《Biologia》：Phenotypic and genotypic characterization of antimicrobial resistance and biofilm formation in Staphylococcus spp. isolated from artisanal coalho cheese
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手工coalho奶酪可能作为包括葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌在内的微生物的传播载体，这些细菌与抗菌药物耐药和生物膜形成相关。本研究旨在通过对细菌鉴定、表型和基因型耐药性以及生物膜形成能力的评估，对分离自手工coalho奶酪的葡萄球菌属（Sta
手工coalho奶酪可能作为包括葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌在内的微生物的传播载体，这些细菌与抗菌药物耐药和生物膜形成相关。本研究旨在通过对细菌鉴定、表型和基因型耐药性以及生物膜形成能力的评估，对分离自手工coalho奶酪的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）分离株进行特征分析。研究人员分析了取自巴西东北部伯南布哥州十个市的20份手工coalho奶酪样品。细菌分离株通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定；抗菌药物敏感性采用纸片扩散法测定；生物膜形成通过结晶紫试验评估，并与耐药和毒力相关的基因通过聚合酶链反应（PCR）进行调查。共获得25株葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）分离株，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为优势菌种，占40.0%，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）各占20.0%。抗菌药物耐药最常见于青霉素（76.0%），其次为头孢西丁（16.0%），12.0%的分离株呈现多重耐药谱。92.0%的分离株观察到生物膜形成，其中36.0%被归类为强生物膜产生者。在分子特征分析中，最常见的基因为norA（76.0%）、norC（44.0%）、tet(38)（40.0%）、blaZ（32.0%）和icaD（32.0%），表明存在与细菌耐药和持续存在相关的决定因子。在手工coalho奶酪中检测到具有生物膜形成能力和抗菌药物耐药基因的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.），强化了该食品作为具有公共卫生意义的细菌潜在储库的重要性。这些发现凸显了在One Health方法框架下对整个食品生产链实施微生物监测和卫生控制策略的必要性。
**研究背景与问题**
手工coalho奶酪在巴西东北部具有重要的文化和经济价值，但其以生牛乳为原料且在卫生条件不足的环境下生产，可能损害产品的微生物质量与安全性。污染可发生于挤奶、储存和加工过程，也可通过接触器具、表面和操作人员发生。在常见污染微生物中，葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌尤为值得关注。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是与乳制品污染和食源性疾病暴发最常相关的菌种，其产生的葡萄球菌肠毒素（特别是SEA、SEB、SEC、SED和SEE）与大多数葡萄球菌食物中毒暴发相关，且因耐热性可在食品中保持活性。部分葡萄球菌种还表现出生物膜形成能力和抗菌药物耐药性，这些特征有利于其在生产环境中持续存在并增加多重耐药菌株传播的风险。已有研究表明，分离自乳腺炎乳汁和奶酪加工环境的葡萄球菌分离株中生物膜产生菌频率较高，且生物膜形成能力与多重耐药谱之间存在关联。然而，尽管手工奶酪中葡萄球菌属时有发生，关于其多样性、生物膜形成能力和抗菌药物耐药谱的信息仍然有限。因此，研究人员开展了本研究，旨在通过评估微生物多样性、抗菌药物耐药谱和生物膜形成能力，对分离自手工coalho奶酪的葡萄球菌属分离株进行特征分析。
**研究方法概述**
研究人员采集了巴西东北部伯南布哥州十个市（Alagoinha、Pedra、Buíque、Garanhuns、S?o Bento do Una、Venturosa、Caetés、Cachoeirinha、Capoeiras和Passira）露天市场和当地商贩的20份手工coalho奶酪样品（2025年3月至8月）。细菌分离株通过MALDI-TOF MS鉴定；抗菌药物敏感性采用纸片扩散法测定，并计算多重抗菌药物耐药指数（MAR index）；生物膜形成通过结晶紫微孔板试验评估；耐药和生物膜相关基因通过PCR检测；数据采用R软件进行相关性分析。
**研究结果**
***葡萄球菌属物种分布***：从20份样品中共回收25株葡萄球菌属分离株。金黄色葡萄球菌（S. aureus）占40.0%（8/20样品，因两个阳性样品中回收了不同菌落形态型而对应25株中的10株），为优势菌种。非金黄色葡萄球菌包括腐生葡萄球菌（S. saprophyticus，5/25，20.0%）、松鼠葡萄球菌（S. sciuri，5/25，20.0%）、木糖葡萄球菌（S. xylosus，3/25，12.0%）和表皮葡萄球菌（S. epidermidis，2/25，8.0%）。
***表型耐药谱***：76.0%（19/25）的分离株对青霉素耐药，16.0%（4/25）对头孢西丁耐药。对庆大霉素和呋喃妥因的耐药各占8.0%（2/25），对妥布霉素、阿米卡星、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、环丙沙星和多西环素的耐药各占4.0%（1/25）。
***生物膜形成能力***：92.0%（23/25）的分离株为生物膜形成者，其中强产生者占36.0%（9/25），中等产生者占36.0%（9/25），弱产生者占20.0%（5/25）。
***多重抗菌药物耐药指数***：MAR指数范围为0.000至0.286，以低值为主：64.0%（16/25）的分离株MAR=0.071，16.0%（4/25）对所测抗菌药物均不耐药（MAR=0.000），12.0%（3/25）MAR≥0.2，为多重耐药谱。
***基因型特征***：最常见的基因为norA（76.0%，19/25），其次为norC（44.0%，11/25）和tet(38)（40.0%，10/25）。blaZ和icaD基因各占32.0%（8/25），icaA和bap各占24.0%（6/25）。
***基因型与表型相关性***：Pearson相关分析显示icaA、icaD、norC、tet38和bap之间存在强正相关，blaZ和norA涉及中等相关。Spearman相关分析显示LNZ与blaZ之间存在中等关联，氨基糖苷类（AMI、TOB）、ERI与blaZ和icaD基因之间存在弱相关。抗菌药物之间的相关性分析显示阿米卡星/妥布霉素和呋喃妥因/头孢噻呋之间存在完全正相关。
**讨论与结论**
讨论部分指出，手工乳制品中存在多样化微生物群落，与食品技术特征相关的微生物可能与潜在致病菌或生产条件不足的指示菌共存。金黄色葡萄球菌在40.0%奶酪中的回收凸显了手工生产链的严重脆弱性。除与亚临床牛乳腺炎相关的生乳污染外，高流行率还反映了零售过程中的加工后暴露。手工coalho奶酪传统上以未经巴氏消毒的生乳制造，加工仅涉及温和的凝乳加热（45–52 °C）和中等盐渍（1.5–2.5% w/w），无法达到致死性巴氏消毒热效应，允许葡萄球菌存活。此外，该奶酪主要以新鲜产品（储存1–5天）或经最低限度成熟后消费，缺乏技术障碍使存活的S. aureus得以在最终零售产品中持续存在。在伯南布哥的露天市场和传统街边摊位中，这些奶酪常在环境温度（>28 °C）下展示，无冷藏、保护性包装或物理屏障，通过切片和分装过程中的持续操作促进二次污染和细菌增殖。其他污染来源包括加工步骤中的操作、器具和设备清洁不充分、接触表面上的生物膜形成、交叉污染以及储存和成熟条件。不充分的技术条件（如制造过程中酸化和温度控制失败）也可能有利于微生物增殖和在最终产品中的维持。关于抗菌药物耐药谱，研究人员观察到对青霉素和头孢西丁的耐药频率最高，这与在其他地区手工奶酪中的发现一致。高生物膜形成能力（92.0%的分离株可产生生物膜，36.0%为强产生者）是最相关的发现之一。icaA、icaD和bap基因的检测强化了分离株的持续存在潜力。blaZ基因在32.0%分离株中的检测强化了该遗传决定因子在食品来源细菌中的循环。一个值得注意的发现是外排泵和四环素耐药决定因子的高流行率与对氟喹诺酮类和四环素类观察到的可忽略表型耐药之间的明显差异。在葡萄球菌属中，norA、norC和tet(38)是染色体决定因子，编码基础外排系统，通常保持转录静默，除非通过启动子突变或化学诱导而过表达。尽管根据MAR指数分离株显示低频率多重耐药，但不同耐药相关基因的同时存在展示了适应潜力。这些发现需在食品安全和One Health框架内加以情境化。葡萄球菌食物中毒主要是由摄入预先形成的耐热肠毒素介导的中毒，而非需要抗生素治疗的有创感染。因此，在手工奶酪中检测到抗菌药物耐药和生物膜产生的葡萄球菌属凸显了One Health范式下的生态储库风险。乳制品分离株中可移动遗传元件和耐药基因的存在代表了一个能够向人类胃肠道内共生或机会性微生物水平基因转移的决定因子库。研究人员也指出了本研究的局限性：探索性设计和零售单位便利抽样主要表征了当地市场背景而非详尽的区域流行率；优先考虑定性分离以捕获物种多样性，后续微生物风险评估中有必要补充定量计数（CFU/g）和葡萄球菌肠毒素谱分析；关键遗传决定因子虽已绘制，但功能试验（如外排泵抑制、转录组表达分析和高分辨率基因组分型）是充分阐明泵激活动力学、克隆谱系和传播途径的有前景的下一步。
研究结论部分翻译如下：分离自伯南布哥手工coalho奶酪的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）分离株携带与适应性、持续存在和具有公共卫生意义特征潜在传播相关的机制。尽管表型谱显示根据MAR指数多重耐药频率较低，但与抗菌药物耐药相关的基因（包括blaZ、norA、norC和tet(38)）的鉴定、高生物膜形成能力以及与细菌黏附相关基因的存在，表明了一个需要在食品生产链中加以关注的场景。这些因素的组合可能有利于这些微生物在生产环境中的持续存在，增加通过常规卫生措施控制的难度，并促进能够传播遗传耐药决定因子的细菌储库的维持。因此，手工coalho奶酪应被理解为动物健康、食品安全和公共卫生之间的接口，强化了持续微生物监测和控制策略的重要性。
