《Glycoconjugate Journal》：Characterization of N-glycosylation remodeling in cerebrospinal fluid extracellular vesicles in children with purulent meningitis and viral meningitis: an exploratory glycomics study based on MALDI-TOF/TOF–MS
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探讨化脓性脑膜炎（PM）、病毒性脑膜炎（VM）与疾病对照（DC）儿童脑脊液（CSF）N-糖基化谱的差异。本回顾性探索性研究纳入6例PM、3例VM患儿及3例处于完全缓解期、无中枢神经系统感染的白血病患儿。经透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotti
探讨化脓性脑膜炎（PM）、病毒性脑膜炎（VM）与疾病对照（DC）儿童脑脊液（CSF）N-糖基化谱的差异。本回顾性探索性研究纳入6例PM、3例VM患儿及3例处于完全缓解期、无中枢神经系统感染的白血病患儿。经透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting对脑脊液来源细胞外囊泡（CSF-EVs）进行表征。采用PNGase F释放N-聚糖，经多孔石墨化碳固相萃取纯化，并以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析。共定量15项衍生糖特征。组间差异采用Kruskal–Wallis检验及两两比较评估，与临床炎症标志物的关联采用Spearman相关分析。CSF N-聚糖谱在三组间呈现不同模式。基于糖特征的分层聚类可将PM、VM与DC样本区分。与DC相比，PM与VM均表现出唾液酸化改变，但重塑模式不同。PM表现为高唾液酸化糖特征增加，而VM表现为双唾液酸化增加及半乳糖化与核心岩藻糖化相关特征降低。平分型GlcNAc相关特征在两个感染组均降低。总平分型GlcNAc（B Total）与血清降钙素原（PCT）水平呈正相关（r = 0.681，P = 0.015）。儿童中枢神经系统感染与CSF N-聚糖的特定重塑模式相关。上述发现为感染相关糖基化改变提供了初步证据，并支持在更大队列中进一步验证。
研究背景：化脓性脑膜炎（PM，即细菌性脑膜炎）与病毒性脑膜炎（VM）是儿童最常见的中枢神经系统感染。PM是5岁以下儿童十大死因之一，病死率可达30%，约50%患儿可遗留听力损失、发育迟缓及运动障碍等神经系统并发症，及时使用抗生素可显著改善临床结局；VM则以对症支持治疗为主，因此快速诊断有助于降低住院率、缩短住院时间、减少医疗费用，并避免不必要的抗生素使用及其后续耐药问题。血清降钙素原（PCT）作为反映全身细菌感染负荷与炎症反应程度的敏感生物标志物，已广泛用于儿童细菌与病毒感染的辅助鉴别，但中枢神经系统感染早期临床表现缺乏特异性，及时区分PM与VM仍是重要临床挑战。近年来外泌体研究为疾病诊断与治疗提供了新视角。外泌体为直径约20–150 nm的细胞外囊泡，由多数细胞类型释放入血液、尿液、脑脊液、唾液及羊水等体液，携带蛋白质、microRNA及脂质等生物分子，参与细胞间通讯与病理过程。脑脊液（CSF）中的外泌体含有来源于神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞的蛋白，参与神经系统发育及多种生理病理过程。除蛋白质与脂质外，细胞外囊泡（EVs）表面还展示O-聚糖、N-聚糖及神经节苷脂等糖鞘脂等多种糖缀合物及糖基化修饰。EV糖基化在细胞间及细胞与基质相互作用、细菌黏附、细胞免疫原性及信号转导等多种疾病过程中发挥关键作用。N-糖基化是寡糖连接至天冬酰胺（Asn）残基酰胺氮的过程，始于内质网（ER）并在高尔基体中完成，不仅影响蛋白质结构与功能，还在调控细胞间相互作用与信号转导中起关键作用，与疾病进展密切相关。多种炎症性疾病中已观察到N-糖基化改变：促炎细胞因子可通过调节参与聚糖生物合成的糖基转移酶与磺基转移酶表达来调控细胞表面糖基化，从而诱导细胞表面特定糖抗原表达，这些抗原可被不同类型凝集素或细菌黏附素识别，进而促进疾病进展；糖基化水平的调节可加重或减轻炎症反应，此类改变可影响细胞信号通路，尤其是NF-κB与MAPK信号通路活性，从而调控炎症的强度与持续时间。糖基化还可通过促进白细胞募集至炎症部位来调节免疫细胞生物学功能，并可能发挥促炎或抗炎作用。蛋白质糖基化与全身炎症反应、自身免疫反应及肿瘤发生之间相互作用的机制尚未完全阐明，仍是活跃的研究领域。迄今，成人神经系统疾病中已有CSF N-糖基化谱改变的报道，但尚无研究探讨PM或VM患儿CSF或CSF来源细胞外囊泡中N-糖基化的改变。因此，进一步研究儿童CSF中N-糖基化改变，不仅有助于加深对儿童中枢神经系统感染发生机制的理解，还可能揭示用于早期鉴别化脓性脑膜炎与病毒性脑膜炎的新型疾病生物标志物。本研究旨在系统表征PM与VM患儿CSF-EVs的N-糖基化谱，探讨不同感染状态下CSF-EV N-糖基化重塑模式，并评估衍生糖特征与临床炎症标志物的关联。研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF–MS）等技术表征EV相关蛋白的N-糖基化谱，或有助于识别与儿童PM及VM相关的候选糖组生物标志物，并为未来开发儿童PM与VM鉴别诊断方法提供初步证据。
研究对象与设计：本研究为在武汉儿童医院开展病例对照研究，CSF样本采集自儿科受试者，分为疾病对照（DC）组、PM组与VM组。DC组为完全缓解期急性白血病患儿，均无发热、头痛、惊厥等提示中枢神经系统感染的症状，CSF常规、生化及病原学检测均无中枢神经系统感染证据，样本取自疾病管理或治疗反应评估中常规腰椎穿刺的残余标本。PM依据临床表现、CSF检查及微生物学证据（CSF培养阳性、病原核酸检测阳性或符合既定细菌性脑膜炎诊断标准）诊断；VM依据脑膜刺激征、神经系统症状、CSF炎症性改变及病毒核酸或血清学检测阳性，或依据既定临床诊断标准诊断。排除标准包括合并严重感染性疾病、遗传或代谢性疾病、自身免疫性疾病、既往神经系统疾病，以及样本量不足或质量不合格。研究共纳入12例儿科CSF样本，其中DC组3例、VM组3例、PM组6例。PM组病原谱存在一定异质性，包括铜绿假单胞菌2例、金黄色葡萄球菌2例、大肠埃希菌1例及肺炎链球菌1例。
主要关键技术方法：CSF经标准腰椎穿刺采集，每例3–5 mL，采集后立即置冰上并于1 h内完成预处理，3,000 × g、4 °C离心15 min后取上清分装保存于?80 °C。CSF标本经10,000 × g、4 °C离心30 min去除细胞碎片后，采用超速离心（140,000 × g、4 °C、70 min）分离EV组分，并以PBS重悬后再次超速离心，所得沉淀即为EV组分；每份CSF标本均独立进行EV分离，组内不合并样本，随后对每份样本分别释放并分析N-聚糖，以保留样本水平可追溯性。EV表征采用三项质控手段：透射电镜（TEM）观察形态；纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定粒径分布与浓度；Western blotting检测EV标志蛋白CD9、CD81、TSG101及细胞污染标志物Calnexin。N-聚糖制备参照Jensen等方案并针对CSF-EV富集样本改良：取含20 μg总蛋白的CSF-EV样本，依次以二硫苏糖醇（DTT）还原二硫键、碘乙酰胺烷基化半胱氨酸，变性蛋白原位固定于预湿PVDF膜并以Direct Blue染色，切取目标蛋白斑点行膜内酶解，加入质谱级重组PNGase F（2 U）于37 °C连续酶解16 h以定量释放连接于Asn残基的N-聚糖。释放的游离N-聚糖经乙酸铵羟基化处理，并于50 °C以硼氢化钠（NaBH4）还原3 h以稳定聚糖还原端，加入冰乙酸终止反应；反应产物依次通过强阳离子交换（SCX）树脂微柱与多孔石墨化碳（PGC）固相萃取（SPE）微柱进行两级脱盐与基质纯化，洗脱液收集后干燥待测。纯化N-聚糖组分采用MALDI-TOF/TOF质谱仪（Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer）分析：干燥糖样以50%（v/v）乙腈复溶，与2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质混合后点样于不锈钢靶板，风干共结晶后于正离子反射模式、约m/z 1,000–5,000范围采集谱图，每个点采集多个激光位置并累加获得代表性谱图，全部样本采用一致参数进行外标校准、基线校正、噪声过滤、m/z值检测与峰心化。单个聚糖信号依据观测m/z值及相应理论N-聚糖组成并考虑相关钠加合物进行归属，结合质量准确度、同位素模式及既往报道的N-聚糖组成评估，并与已发表聚糖注释及GlycoStore数据库条目交叉核对。检测到的聚糖按主要组成与结构特征分类，包括高甘露糖、杂合型、复杂型、岩藻糖化及唾液酸化聚糖；与含额外HexNAc残基的双天线复杂型N-聚糖组成一致者，在与既往报道结构注释一致时归类为平分型相关聚糖，该命名属基于组成、结构信息指导的赋值，并非对样本中平分型GlcNAc的确证，因未对每个聚糖进行异构体特异性分离与直接结构确证。每个可重复检测的聚糖赋予唯一基于m/z的标识符。为进行比较分析，各注释聚糖强度以相应谱图中全部注释聚糖信号总强度归一化，获得单个N-聚糖的相对丰度，随后按预设组成与结构类别计算糖衍生特征。数据分析采用自编MATLAB R2014b函数与Perl脚本完成预处理、归一化与整合，统计分析使用RStudio、SPSS、Perseus v1.6.10.43及GraphPad Prism 9；连续变量正态性以Shapiro–Wilk检验初步评估，正态分布数据采用单因素方差分析（ANOVA），非正态分布数据采用Kruskal–Wallis检验。15项衍生糖特征的组间比较报告未校正的名义P值，P < 0.05视为具有统计学意义，P值在0.05与0.10之间视为潜在趋势，不作确证性结论而作为供后续大队列验证的假设生成性观察；探索性差异筛选中涉及单个聚糖m/z值的多重比较采用Benjamini–Hochberg法校正并计算错误发现率（FDR），校正P值（Padj）< 0.05视为具有统计学意义。采用Spearman相关分析评估糖特征与CSF临床参数的关系，所有统计检验均为双侧，P < 0.05视为具有统计学意义；需注意各组样本量较小（DC组n = 3，VM组n = 3，PM组n = 6），统计效能有限，P值在0.05与0.10之间的参数谨慎解释为潜在趋势，不作为组间差异的确证证据。
研究结果：
临床与生化特征：共纳入12例儿科CSF样本，PM组病原谱包括铜绿假单胞菌2例、金黄色葡萄球菌2例、大肠埃希菌1例及肺炎链球菌1例，各组临床与生化特征见表1。
分离细胞外囊泡的表征：TEM、NTA与Western blotting作为质控（QC）程序用于表征分离的EV并评估EV制备质量，而非用于探究疾病组间差异。TEM显示囊泡直径约20–200 nm，呈球形或杯状形态并可见双层膜。NTA显示平均粒径123.7 nm，颗粒浓度6.7 × 1012 particles/L。Western blotting显示EV相关标志蛋白CD9、CD81与TSG101存在，而细胞污染标志物Calnexin缺失。上述互补分析从形态、粒径与浓度及蛋白标志物层面为EV的成功分离与基本表征提供了证据，这些QC评估旨在确立分离EV制备适用于后续N-糖组学分析，并非用于建立DC、PM与VM组间EV特征的比较差异。
DC、PM与VM组CSF-EV N-聚糖相对丰度的比较：为评估各组N-聚糖改变的整体模式，研究人员分析了DC、PM与VM组结构类别及特定糖衍生特征的相对丰度。中性聚糖相对丰度在两个感染组均低于DC组，由DC组的56.37%降至PM组的31.70%与VM组的35.16%。与既往报道一致，唾液酸化聚糖相对丰度在PM组与VM组（分别为67.46%与64.40%）高于DC组（43.08%）。岩藻糖化聚糖呈相反趋势，其相对丰度由DC组的48.46%降至PM组的34.53%，VM组呈中间值40.08%。总体而言，上述组成谱提示化脓性脑膜炎与病毒性脑膜炎与CSF N-糖组改变相关，其特征为中性聚糖相对丰度降低、唾液酸化聚糖比例升高及岩藻糖化聚糖相对DC组减少。此外，为更直观呈现三组N-聚糖谱，比较了各聚糖信号在三组间的平均相对强度，并展示了原始质谱数据中平均相对强度较高的聚糖信号，以更清晰显示优势信号与整体聚糖谱模式。为进一步表征CSF N-聚糖改变背后的结构特征，基于已鉴定的N-聚糖计算了多项糖衍生特征，包括平分型聚糖、唾液酸化及高甘露糖聚糖，以评估不同感染状态下N-聚糖结构组成的变化。在糖衍生特征中，平分型N-聚糖相关特征在三组间差异相对明显。Kruskal–Wallis检验显示B Total在DC、VM与PM组间差异显著（P = 0.0455）。进一步分析显示B Neutral在三组间亦差异显著（P = 0.0482），提示所观察到的平分型N-聚糖改变主要归因于中性平分型结构而非唾液酸化平分型结构的变化。除平分型结构外，唾液酸化相关特征呈现组间变异的潜在趋势。S Total在三组间呈接近显著的差异（P = 0.0656），提示感染状态可能与CSF N-聚糖末端唾液酸化调控相关。高甘露糖N-聚糖（Man）亦呈组间差异分布的潜在趋势（P = 0.1034），提示N-聚糖成熟与加工可能受感染相关微环境影响。鉴于样本量有限，上述临界P值应视为假设生成性发现而非确证证据，其稳健性需在更大队列中验证。
回顾性研究队列的临床基线与生化特征：腰椎穿刺时，DC组患儿经系列细胞学评估与流式细胞术确认无中枢神经系统白血病（CNSL）累及，且无合并活动性继发感染，因此DC组被认为是代表无活动性中枢神经系统感染的治疗后中枢神经系统微环境的合适参照组。对各组关键CSF与外周炎症参数进行统计比较与可视化，以表征不同感染状态相关的定量差异，并为后续糖组特征与临床参数的相关分析提供参考。关键CSF参数的定量分析显示，与未感染DC基线相比，VM组CSF白细胞（WBC）计数与CSF蛋白水平显著升高（P < 0.05）。尽管PM组CSF WBC计数与蛋白水平中位数在数值上更高，但与DC组相比差异未达统计学意义（P > 0.05，ns），该发现可能归因于PM组内疾病严重程度与就诊时机的显著个体间异质性，例如2例患儿（P3与P4）的WBC计数与蛋白水平明显高于其余PM样本。同时，以血清PCT水平评估的外周炎症状态在三组间无显著差异（P > 0.05，ns），这可能提示由于基础恶性肿瘤与化疗暴露，DC组外周免疫系统可能处于与活动性感染无关的独特基线状态；该观察背后的机制超出本数据集范围，值得进一步研究。
不同感染暴露下的整体CSF N-糖基化谱与分子分型：为评估急性病原侵袭是否实质性破坏治疗后基线状态所建立的中枢聚糖稳态，基于15项主要CSF N-糖特征的相对丰度进行无监督分层聚类。无监督分层聚类分析将回顾性队列分为三个不同簇，所得分类与临床诊断大体一致。上述发现提示CSF-EV N-糖基化谱可能具有区分不同病原暴露状态的潜力；然而，鉴于样本量（n = 12）相对于特征维度（15项特征）有限，聚类结果可能易受过拟合影响，其区分性能需在更大队列中验证。整体糖组谱显示，未感染DC基线样本（D1–D3）特征性聚居于以基础核心聚糖框架（G0 Total、G1 Total、G Total、F Neutral与F Total）及平分型聚糖结构（B Neutral与B Total）为主的高丰度区域，在热图中表现为显著的高强度红色Z分数条带。急性病原侵袭后，这一治疗后病理稳态发生显著且具结构特异性的重塑。PM簇呈现向高天线数、多唾液酸化复杂聚糖结构的特征性分子偏移，S4 Total与S3 Total在多数PM样本中明显富集，以样本P5最为显著，此富集伴随作为DC基线特征的基础核心聚糖框架（G0/G1/G Total）的协同耗竭与下调。VM簇呈现明显不同的分子谱，主要特征为双唾液酸化聚糖（S2 Total）与总唾液酸化（S Total）的选择性升高，以样本V3尤为明显；与PM组相比，高天线多唾液酸化结构在VM队列中仍处于极低丰度，VM组在三组中亦表现出最明显的基础核心聚糖结构系统性耗竭。
CSF糖基化特征与中枢临床参数的相关与回归分析：在确立不同感染状态下CSF-EV糖组谱的特征性分子模式后，研究人员进一步探究这些聚糖改变是否与患儿实际炎症状态存在定量关联。对8项核心糖特征与队列中可获得的连续临床变量进行Spearman相关分析。相关分析显示总平分型GlcNAc（B Total）与外周血清PCT水平呈显著正相关（r > 0.5，P < 0.05），而所考察的其他糖特征（包括Man、G0/G1/G2/G Total、F Total、F Neutral与S Total）与任何可获得的中枢或外周常规临床参数均无统计学显著相关。XY线性回归模型进一步定量证实外周血清PCT水平与CSF中B Total相对丰度呈强正相关（回归系数r = 0.681，P = 0.015）。回顾性散点图分布检查显示，部分无脑膜炎的疾病对照样本（DC组，图中标注为N Group）表现出相对较高的外周PCT水平并伴CSF B Total丰度升高。由于DC组为缓解期白血病患儿，其基础疾病状态与既往治疗史可能影响全身糖基化稳态；既往研究显示血液系统恶性肿瘤患者血清蛋白N-糖谱可发生改变，提示肿瘤相关病理状态可能参与全身糖基化环境的调控。此外，包括化疗及其他全身治疗在内的临床干预可诱导血清N-糖组的动态重塑。因此，DC组中观察到的B Total富集可能部分反映与基础疾病或既往治疗暴露相关的糖基化特征，而非仅反映感染状态。在PM与VM组所观察到的急性中枢神经系统感染期间，这一潜在基线稳态可能受感染相关炎症反应影响，导致CSF N-糖组进一步重塑及B Total分布模式的改变。然而，由于本研究未对治疗方案、化疗时机或疾病缓解状态对糖基化谱的影响进行分层，B Total在不同临床状态下的动态变化及其与感染过程的具体调控关系需在更大前瞻性队列中进一步验证。
讨论与结论：研究发现脑膜炎患儿CSF中存在细胞外囊泡，与既往成人CSF研究一致。TEM证实囊泡呈典型杯状或球形形态并具完整双层膜；NTA进一步显示囊泡主要分布于外泌体典型物理尺寸范围（50–200 nm），中位粒径（X50）为123.7 nm，呈单一优势粒径的异质性分布；Western blotting显示跨膜蛋白CD9与CD81及内体分选复合物相关蛋白TSG101强而一致的表达，而内质网污染标志物Calnexin完全缺失。上述方法学表征与既往成人CSF及神经系统疾病队列中EV表征的报道高度一致。高分辨率MALDI-TOF–MS可精确量化中枢神经系统感染患者与对照CSF样本间N-聚糖谱差异。研究识别出多项感染相关N-糖基化改变，包括聚糖类别分布的定量变化（如高甘露糖聚糖的差异趋势，提示N-聚糖成熟与加工可能受感染状态影响），以及复杂N-聚糖关键结构特征的改变，包括平分型GlcNAc修饰、多天线唾液酸化、半乳糖化及岩藻糖化。重要的是，CSF N-聚糖谱显示出区分中枢神经系统感染患者与对照、并可能区分不同病原感染类型的潜力，无监督分层聚类分析进一步支持该观察。既往感染性疾病糖组研究显示，基于血清N-糖谱的无监督分层聚类可有效揭示不同感染状态患者的分子分层模式，为利用糖特征进行疾病亚型分类提供了依据。上述发现提示CSF-EV N-聚糖谱可能具有跨不同感染状态的区分潜力；但如前所述，因样本量有限，该观察仍有待验证。PM组CSF中呈现高天线多唾液酸化复杂结构的显著富集，而VM组呈现双唾液酸化结构的特征性增加；相反，疾病对照组以平分型聚糖结构相对高丰度为特征。值得注意的是，PM组内CSF WBC计数与蛋白水平存在显著个体间变异，除疾病严重程度差异外，该变异可能部分与部分患儿在诊断性腰椎穿刺前接受经验性抗生素治疗有关，这是回顾性研究中常见的临床混杂因素；但本研究未系统记录抗生素给药的确切时机，无法直接评估该假设。在所研究的两种中枢神经系统感染中，PM组N-聚糖谱异常最为显著。PM患儿CSF以高天线多唾液酸化结构（S3 Total与S4 Total）富集为特征，并伴基础核心聚糖框架的系统性下调。基于既往神经感染与免疫机制研究，可假设细菌侵袭强烈刺激中枢神经系统浸润的小胶质细胞与星形胶质细胞以及大量募集中性粒细胞（与本研究中PM组CSF WBC计数显著升高一致），从而可能增加局部唾液酸转移酶活性。既往研究提示末端多唾液酸化残基可能通过与补体调节因子相互作用参与限制过度补体激活；唾液酸–Siglec相互作用已知参与免疫调控。CSF-EVs上多唾液酸化特征（S3 Total与S4 Total）在PM组的富集因此可能与此类保护性调控机制有关；但该解释仍属推测，需通过功能研究（如补体活性测定与Siglec结合实验）直接验证。相反，VM组呈现明显不同的分子谱与重塑模式。VM患者样本主要显示双唾液酸化（S2 Total）的适度增加，而基础核心聚糖框架（G0 Total、G1 Total、G Total、F Neutral与F Total）呈系统性耗竭与下调。病毒感染可能诱导内皮细胞与神经元内质网应激（ER stress），并干扰高尔基体关键聚糖加工酶（如半乳糖基转移酶与岩藻糖基转移酶）的正常功能，该机制可能是VM组基础核心聚糖框架（G0/G1/G Total、F Neutral与F Total）显著下调的一种潜在解释。既往研究亦提示核心糖基化减少可能与血脑屏障紧密连接蛋白稳定性受损相关，或可部分解释VM患儿CSF蛋白水平升高；但本研究未直接检测紧密连接蛋白与ER应激相关标志物，故此解释仍属推测，需在未来机制研究中证实。平分型聚糖结构（B Neutral与B Total）在DC组保持相对高丰度，但在PM与VM组均显著降低，提示该改变可能与感染状态本身相关，而非特定感染类型所特有。既往研究报道，由MGAT3介导的糖基化所生成的平分型结构可通过空间位阻效应限制聚糖末端的进一步延伸与修饰，从而发挥“限速”式调控机制。研究人员因此假设，DC组患儿免疫稳态可能受基础疾病与化疗暴露影响，维持相对较高水平的平分型聚糖修饰；急性中枢神经系统感染时，免疫反应对末端唾液酸化与高天线结构的需求增加，可能导致该限速机制下调，从而促使聚糖加工向复杂型与多唾液酸化结构偏移。该假设与本研究观察到的B Total与血清PCT正相关在方向一致，但需直接验证，如测定MGAT3表达。研究局限性包括：第一，样本量小（DC组n = 3，VM组n = 3，PM组n = 6），统计效能有限，P值在0.05与0.10之间的参数应解释为潜在趋势而非确证性差异，需在更大队列中验证。值得注意的是，PM组铜绿假单胞菌感染比例相对较高（2/6），与儿童社区获得性细菌性脑膜炎的典型流行病学特征不同（后者以肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌与流感嗜血杆菌为主）；该差异可能与所有受试者均来自三级儿科医院、部分患儿存在基础疾病或既往医疗暴露有关。既往研究显示铜绿假单胞菌脑膜炎更常见于医疗相关感染、神经外科术后或免疫功能受损患者。由于样本量有限且未进行病原分层分析，糖基化重塑是否因致病病原不同而存在差异仍有待更大规模研究确定。与既往报道一致，本研究所观察到的CSF糖基化局部改变可能与外周血炎症标志物存在时间或空间上的分离。此外，由于为回顾性研究，PM组部分患儿可能在诊断性腰椎穿刺前接受经验性抗生素治疗，这可能造成CSF WBC计数与蛋白水平的组内显著变异，以及相较DC组缺乏统计学显著差异；但因抗生素给药时机未系统记录，无法进行敏感性分析以评估该潜在混杂效应。鉴于样本量有限及研究的探索性，未对差异糖特征进行诊断性能分析，包括受试者工作特征（ROC）曲线、曲线下面积（AUC）、灵敏度与特异度；此外，讨论中提出的机制假设未通过功能实验直接验证，如MGAT3表达分析、补体活性测定或Siglec结合实验。总之，本探索性研究提供初步证据表明中枢神经系统感染可能伴随CSF-EV N-糖基化的特征性重塑，且不同病原感染类型呈现可区分的重塑模式。基于高分辨率质谱（MALDI-TOF–MS）的定量糖特征谱为儿童细菌性与病毒性中枢神经系统感染的鉴别诊断提供了新的分子视角与假设生成框架，这些糖组特征的临床效用仍有待更大队列验证。
