《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Bisdemethoxycurcumin disrupts Chk1-associated DNA damage checkpoint signaling and induces apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells
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姜黄素类化合物因其多样的生物活性（包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用）已被广泛研究。其中，双去甲氧基姜黄素（BDMC）已被报道在多种癌症类型中抑制肿瘤增殖和转移。然而，BDMC在鼻咽癌（NPC）中作用的分子机制仍不清楚。采用免疫印迹、流式细胞术、免疫细胞化学和细胞热
姜黄素类化合物因其多样的生物活性（包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用）已被广泛研究。其中，双去甲氧基姜黄素（BDMC）已被报道在多种癌症类型中抑制肿瘤增殖和转移。然而，BDMC在鼻咽癌（NPC）中作用的分子机制仍不清楚。采用免疫印迹、流式细胞术、免疫细胞化学和细胞热位移分析（CETSA）检测了BDMC对凋亡、细胞周期进程、DNA损伤和Chk1活性的影响。使用BIOVIA Discovery Studio 2024进行分子对接和分子动力学模拟。结果表明，BDMC通过诱导NPC细胞的内源性和外源性凋亡途径发挥细胞毒性作用。c-Jun N末端激酶（JNK）信号通过抑制JNK磷酸化参与凋亡诱导。同时，BDMC直接结合检查点激酶1（Chk1）并抑制其磷酸化。BDMC对Chk1的抑制导致检查点控制破坏、S期和G2/M期阻滞以及DNA损伤积累，伴随Chk1磷酸化的显著失活而不改变总Chk1蛋白表达。值得注意的是，CHEK1沉默未显著改变BDMC诱导的caspase激活或凋亡，而用Z-VAD抑制caspase依赖性凋亡不影响BDMC诱导的γH2AX积累。这些发现表明，在所检测的条件下，BDMC诱导的凋亡反应和Chk1相关DNA损伤反应在功能上是可以分离的。本研究揭示了BDMC的抗肿瘤作用涉及JNK相关凋亡信号和Chk1介导的检查点功能障碍的差异性调控。这些发现为BDMC诱导的细胞毒性提供了机制见解，并支持其作为鼻咽癌进一步药理学研究的先导化合物的潜力。
鼻咽癌（NPC）是起源于鼻咽上皮衬里的恶性肿瘤，具有显著的地域和种族分布特征，超过70%的新发病例发生在东亚和东南亚。尽管全球鼻咽癌发病率因人口老龄化而逐渐增加，但在高发地区，由于生活方式改善和诊断技术的进步，发病率和死亡率均呈下降趋势。然而，台湾地区男性发病率（每10万人6.01–6.52例）仍显著高于全球平均水平（每10万人1.3例）。EB病毒（EBV）感染被认为是鼻咽癌的主要病因学因素，临床筛查通常涉及血浆EBV抗体检测和鼻咽镜检查。鼻咽癌对放疗高度敏感，调强放疗的应用进一步提高了肿瘤靶向的精确性和患者生存率。对于晚期鼻咽癌，同步放化疗（CCRT）及诱导化疗后序贯CCRT是标准治疗策略。然而，化疗耐药和治疗失败仍然是主要的临床挑战。鉴于这些局限性，寻找具有治疗潜力的天然化合物已成为重要的研究方向。姜黄在印度、中国和印度尼西亚等国长期作为膳食成分和传统草药使用，因其广泛的药理特性，历史上被用于治疗血脂异常、胃功能障碍、关节炎和肝脏疾病等。姜黄的主要生物活性成分是姜黄素类化合物，包括姜黄素及其衍生物去甲氧基姜黄素（DMC）和双去甲氧基姜黄素（BDMC），已被报道具有抗氧化、抗炎、抗增殖和抗转移作用。其中，BDMC因缺少两个甲氧基而具有优于姜黄素和DMC的化学稳定性。值得注意的是，BDMC已被证明可抑制肺癌和宫颈癌细胞的肿瘤转移，并诱导胃腺癌、骨肉瘤和胰腺癌细胞的凋亡。然而，BDMC在鼻咽癌中抗癌活性的分子机制仍不完全清楚。本研究旨在通过研究BDMC对细胞增殖和凋亡的影响，并利用分子对接表征其与肿瘤发生中涉及的关键分子靶标的潜在相互作用，来阐明BDMC在鼻咽癌中的调控作用。
研究人员开展了以下研究：首先，采用WST-8法检测BDMC对两种鼻咽癌细胞系NPC-039和NPC-BM的细胞毒性，计算半数抑制浓度（IC50）；通过克隆形成实验检测BDMC对细胞长期增殖能力的影响。其次，采用DAPI染色和Annexin V/PI双染流式细胞术检测BDMC对凋亡的诱导作用；通过JC-1探针检测线粒体膜电位（MMP）变化；通过免疫印迹检测内源性和外源性凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bak、Bim、DR5、FAS、RIP、cleaved caspase-3/8/9、cleaved PARP）的表达变化；并通过Z-VAD共处理验证caspase依赖性凋亡。第三，通过免疫印迹检测MAPK通路蛋白（p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38）的磷酸化水平，并使用ERK抑制剂U0126和JNK抑制剂JNK-IN-8进行药理学干预以确定功能性关联。第四，通过流式细胞术检测细胞周期分布，通过免疫细胞化学检测γH2AX焦点形成以评估DNA损伤，通过免疫印迹检测细胞周期相关蛋白（Cdc2、CDK2、CDK4、p21）的表达。第五，利用BIOVIA Discovery Studio 2024的PharmaDB模块筛选BDMC的药理学靶标，并进行分子对接和100 ns分子动力学模拟评估Chk1–BDMC复合物的结合模式和稳定性。第六，采用细胞热位移分析（CETSA）验证BDMC与Chk1的直接结合，通过免疫印迹检测Chk1总蛋白及磷酸化水平（Ser296、Ser317、Ser345）和Cdc25C磷酸化及总蛋白水平，并通过BDMC与Chk1抑制剂prexasertib联合处理评估功能重叠。最后，通过siRNA介导的CHEK1沉默和Z-VAD药理学抑制探讨凋亡反应与Chk1相关DNA损伤反应的功能关系。研究得出以下结论：BDMC通过抑制JNK磷酸化诱导内源性和外源性凋亡途径；同时BDMC直接结合Chk1的ATP结合口袋并抑制其激酶活性，导致细胞周期阻滞和DNA损伤积累；BDMC诱导的凋亡反应与Chk1相关DNA损伤反应在功能上可分离。这些发现将BDMC鉴定为多靶点抗癌剂，可协调破坏应激信号和检查点控制，支持其作为先导化合物进行进一步的临床前和转化研究。
研究人员采用的关键技术方法包括：WST-8细胞活力检测和克隆形成实验评估细胞增殖；流式细胞术进行Annexin V/PI凋亡分析和PI细胞周期分析；JC-1探针检测线粒体膜电位；免疫印迹和免疫细胞化学检测蛋白表达和磷酸化水平及γH2AX焦点；细胞热位移分析（CETSA）验证药物与靶蛋白的直接结合；BIOVIA Discovery Studio 2024进行分子对接和分子动力学模拟；siRNA介导的基因沉默。细胞系NPC-039和NPC-BM由彰化基督教医院血液肿瘤科Jen-Tsun Lin博士提供。
研究结果：
BDMC对鼻咽癌细胞的细胞毒性作用：通过WST-8法检测BDMC对NPC-039和NPC-BM细胞的IC50分别为59.54 μM（95% CI，55.61至63.75 μM）和61.81 μM（95% CI，58.27至65.57 μM）。BDMC在20、40和60 μM浓度下对鼻咽癌细胞表现出时间和剂量依赖性细胞毒性。克隆形成实验显示BDMC抑制鼻咽癌细胞的长期增殖能力。
BDMC诱导鼻咽癌细胞凋亡：通过DAPI染色观察到BDMC处理后DNA凝聚程度呈浓度依赖性增加。FITC/PI双染流式细胞术显示BDMC处理后凋亡群体显著增加。在内源性途径中，BDMC处理导致Bcl-2下调，Bak和Bim表达上调。在外源性途径中，DR5和FAS蛋白上调，RIP蛋白下调。JC-1荧光探针检测显示BDMC处理后鼻咽癌细胞线粒体膜电位去极化。免疫印迹证实BDMC处理后cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9和cleaved PARP水平显著升高。Z-VAD共处理部分逆转BDMC诱导的细胞死亡，证实BDMC通过caspase依赖性途径诱导凋亡。
BDMC通过抑制JNK信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡：免疫印迹显示BDMC处理显著降低磷酸化ERK和JNK水平，而磷酸化p38基本不变。JNK抑制剂JNK-IN-8与BDMC共处理显著增强caspase-3、caspase-8和PARP的切割，而ERK抑制剂U0126未观察到协同效应。这些发现表明BDMC主要通过JNK信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡。
BDMC诱导细胞S期和G2/M期积累及DNA损伤：流式细胞术分析显示随BDMC浓度增加，细胞在S期和G2/M期显著积累，G0/G1期群体明显减少。免疫细胞化学显示BDMC处理显著增加γH2AX荧光强度，证实DNA损伤诱导。免疫印迹显示细胞周期相关蛋白Cdc2、CDK2和CDK4下调，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21上调。
Chk1被鉴定为BDMC的潜在分子靶标：利用Discovery Studio 2024的PharmaDB模块筛选鉴定出296个药效团模型，其中代表Chk1的模型4fsw拟合值最高。分子对接显示BDMC与Chk1的结合能为?39.2154 kcal/mol，BDMC与Chk1 ATP结合口袋中的Cys87和Lys38两个关键残基形成氢键。分子动力学模拟100 ns轨迹的RMSD分析显示前20 ns内发生初始结构重排后趋于稳定，RMSF分析显示结合界面处Lys38和Cys87残基波动减小，支持BDMC与Chk1之间稳定的结合模式。
BDMC结合Chk1并抑制Chk1相关检查点信号：CETSA实验显示BDMC存在下Chk1热稳定性增强，NPC-039细胞中Chk1熔解温度从49.32 ± 1.00 °C升高至53.33 ± 1.01 °C，NPC-BM细胞中从49.10 ± 1.01 °C升高至53.83 ± 1.01 °C，证明BDMC直接结合并稳定Chk1。BDMC处理后总Chk1蛋白水平不变，而Ser296、Ser317和Ser345位点磷酸化显著降低。BDMC降低Cdc25C Ser216位点磷酸化，总Cdc25C丰度也降低。BDMC或prexasertib单药处理均将鼻咽癌细胞活力降至约50%，共处理未进一步降低细胞活力，提示通路重叠并支持Chk1作为共享功能节点。
BDMC诱导的凋亡和Chk1相关DNA损伤反应在功能上可分离：CHEK1 siRNA转染 confirmed CHEK1 mRNA显著降低及Chk1蛋白表达相应减少。然而CHEK1沉默未显著改变BDMC诱导的cleaved caspase-3、cleaved caspase-8或cleaved PARP水平，Annexin V/PI分析显示si-NC + BDMC组与si-CHEK1 + BDMC组凋亡群体无显著差异。Z-VAD抑制caspase未显著改变BDMC诱导的γH2AX积累。这些发现表明在所检测条件下BDMC诱导的凋亡和Chk1相关DNA损伤反应在功能上可分离。
讨论部分总结：本研究发现在鼻咽癌细胞中，BDMC通过互补机制调控细胞增殖。BDMC抑制MAPK信号通路的JNK分支促进凋亡和细胞死亡，同时引起S期和G2/M期细胞周期阻滞，伴随DNA损伤标志物γH2AX升高。分子对接、分子动力学和热位移实验表明BDMC占据并稳定Chk1的ATP结合位点，抑制Chk1在Ser296、Ser317和Ser345位点的磷酸化，损害Chk1介导的DNA损伤修复能力，导致DNA损伤积累和细胞存活降低。研究人员讨论了JNK信号在不同细胞类型和刺激背景下发挥促凋亡或促存活功能的背景依赖性，并指出本研究中BDMC抑制JNK磷酸化是鼻咽癌细胞凋亡的主要驱动因素。关于Chk1的结构分析，研究人员详细阐述了Lys38和Cys87在ATP结合和激酶活性中的关键作用，分子对接显示BDMC与这两个残基形成稳定氢键，可能干扰ATP正确定位。研究还讨论了BDMC诱导的Chk1磷酸化模式与典型ATP竞争性Chk1抑制剂的不同之处，BDMC同时降低Ser296自磷酸化和ATR依赖性Ser317/Ser345磷酸化，提示BDMC直接结合Chk1改变其可及性或构象，而非主要抑制ATR。下游Cdc25C磷酸化和丰度降低以及Cdc2、CDK2、CDK4下调共同表明细胞周期调控机制破坏。BDMC与prexasertib共处理未进一步抑制细胞活力，支持两者汇聚于共享的Chk1依赖性功能节点。CHEK1沉默和caspase抑制实验支持BDMC诱导的凋亡和Chk1相关检查点反应是平行的而非单一线性信号通路。研究承认以下局限性：BDMC的临床适用性可能受药代动力学因素限制，未来纳米颗粒递送系统可能增强生物利用度；缺乏体内验证，需要动物研究评估抗肿瘤疗效、药效动力学和安全性。尽管如此，本研究首次鉴定Chk1为BDMC的直接分子靶标，并证明BDMC通过Chk1结合和检查点破坏诱导DNA损伤。
研究结论部分翻译：总之，本研究表明BDMC通过抑制JNK磷酸化诱导内源性和外源性凋亡途径。同时，BDMC直接结合Chk1的ATP结合位点并抑制其激酶活性，导致细胞周期阻滞和DNA损伤积累。这些发现共同将BDMC鉴定为一种多靶点抗癌剂，可协调破坏应激信号和检查点控制，支持其作为先导化合物进行进一步临床前和转化研究的潜力。
