融合预训练蛋白质与分子语言模型表征及量子力学特征的KM预测框架（LM2KM）

《Digital Discovery》：LM2KM: feature extraction from pretrained protein and molecular language models combined with quantum mechanics (QM) features for KM predictionsOpen Access

米氏常数（KM）是表征酶-底物相互作用的关键参数，在酶动力学建模和生理药代动力学（PBPK）应用中发挥重要作用。然而，实验测定KM费时费力，现有计算预测方法在准确性和可扩展性方面仍存在局限。本研究系统评估了预训练蛋白质与分子语言模型用于KM预测的性能，整合四种蛋白质语言模型（PLMs）与两种分子语言模型（MLMs）分别编码酶序列和底物结构。采用主成分分析（PCA）进行特征降维，并评估了广泛的表征组合。结果表明，基于ProtT5最后四层约70个特征所衍生的蛋白质表征，结合MolFormer的20个基于CLS的分子特征，为KM预测提供了均衡且高效的表征。此外，量子力学（QM）描述符的引入在所有受测配置中均持续提升预测性能，模型R²达0.537。总之，本研究为大规模KM预测提供了灵活且可扩展的框架，在酶通路识别、药物与先导化合物筛选以及基于序列的蛋白质设计方面具有较大潜力，可支持酶动力学驱动建模与药物开发中的更广泛应用。

研究背景方面，药物药代动力学（PK）过程的理解是药物开发的关键环节，其中代谢清除率的表征最具挑战性。生理药代动力学（PBPK）建模作为自下而上的方法，较传统自上而下群体PK建模具有降低过拟合风险和更强机制依赖等优势。在PBPK模型中，酶动力学参数对描述药物代谢至关重要，米氏常数（KM）表示反应速率达到最大值一半时的底物浓度，是酶-底物亲和力的关键决定因素。然而KM的实验测定费时费力，尤其在药物发现早期阶段常无法获得，KM预测工具有限且性能欠佳，导致新建分子实体（NMEs）的PBPK模型构建面临显著数据缺口。在机器学习广泛应用之前，量子力学（QM）与分子力学（MM）等物理方法被用于KM预测，通过QM/MM势能面估算活化自由能并经过渡态理论推导表观KM；定量构效关系（QSAR）模型则通过将可计算的分子结构与理化描述符关联实验测量值进行预测。随着机器学习与深度学习的发展，数据驱动方法包括深度神经网络和图神经网络被越来越多地应用于酶动力学参数预测，预训练蛋白质与分子语言模型亦逐渐用于特征提取。然而，不同语言模型方法之间因评价指标不统一和训练数据集异质而难以系统比较；纯数据驱动模型常缺乏可解释性且产生的高维表征对下游任务可能非最优；此外部分涉及蛋白质序列的机器学习研究依赖酶委员会（EC）编号进行数据管理，忽视了单一蛋白质序列可能对应多个EC注释的问题，从而引入输入歧义并损害数据质量。

针对上述问题，研究人员开展了LM2KM（Language Model to KM）研究，系统整合四种预训练蛋白质语言模型（PLMs，包括ProtT5、ESM-2、ProtBERT和Ankh）与两种分子语言模型（MLMs，包括ChemBERTa和MolFormer）生成用于KM预测的嵌合表征，旨在识别最适合该任务的语言模型组合与特征维度。该建模工作依托大规模且经过精心管理的数据集，通过广泛的数据清洗与验证流程确保高质量。除语言模型衍生表征外，还引入量子力学（QM）特征以提供化学反应性的互补描述，实现对酶-底物相互作用超越纯统计表征的更全面刻画。与以往研究相比，本研究的数据管理在蛋白质序列层面而非基于EC编号进行，框架可处理涉及多个蛋白质序列的反应；针对许多蛋白质语言模型固有的输入长度限制，采用重叠滑动窗口策略以有效表征长蛋白质序列。研究提供了直接从蛋白质序列和分子表征预测KM值的实用框架，无需实验测定的蛋白质和分子三维结构，可识别潜在代谢通路、筛选特定酶的候选底物并估算相关药代动力学参数，从而在数据有限条件下支持PBPK模型开发，并有望通过关联序列层面变异与功能动力学结果扩展至蛋白质序列工程。研究结论表明，本研究系统实施了4种PLMs和2种MLMs用于蛋白质与底物嵌合提取以支持下??KM预测，识别出由ProtT5 PLM最后四层衍生的70个蛋白质特征与MolFormer MLM的20个基于CLS的分子特征组成的特征配置为均衡有效的KM预测表征，特征维度进一步增加仅带来边际性能提升；引入QM描述符进一步改善模型性能，在其余条件相同情况下R²达0.537。该研究提供了灵活且可解释的框架，在酶通路识别、大规模药物候选筛选和基于序列的蛋白质设计方面具有较大潜力，支持酶动力学驱动建模与药物开发中的更广泛应用。

技术方法方面，研究数据提取自BRENDA数据库（2025年1月检索），包含55 965条关联实验测定KM值的底物-蛋白质对记录，底物经InChIKey映射至PubChem规范SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System），蛋白质序列基于UniProt ID检索。数据清洗以氨基酸序列层面定义蛋白质唯一性进行去重，最终保留8802条唯一蛋白质序列和4951条唯一底物SMILES，去冗余后保留20 462条唯一底物-蛋白质组合，重复组合的KM值取log₂平均。特征提取采用四种PLMs和两种MLMs，对超出输入长度的蛋白质序列应用重叠滑动窗口策略（每窗口510个氨基酸，步长256个氨基酸），并对各模型输出应用主成分分析（PCA）降维。QM计算使用Gaussian 16软件在ωB97XD/6-31G*水平进行几何优化与布居分析，基于最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）能量推导全局反应性描述符。预测模型采用集成装袋树（ensemble bagged trees）算法并以Python实现，对数据上下各10%样本施加额外权重，以决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）评价性能。

研究结果方面，在建模框架与数据集概述中，研究人员提出LM2KM框架，以蛋白质氨基酸序列和底物SMILES字符串为输入提取嵌合表征，经PCA降维后系统评估不同PLM-MLM组合与主成分数量；数据集包含20 462条KM记录，18 225个反应涉及单一蛋白质、1556个涉及两个蛋白质，EC 1类（氧化还原酶）7103个反应占比略超三分之一为最大类别，log₂转换后KM值呈近正态分布（中位数?2.19，第10与第90百分位分别为?7.20和2.87）。在PLMs与MLMs嵌合提取及PCA变换中，共构建10种蛋白质衍生特征表征和4种分子衍生特征表征，ProtBERT衍生特征收敛极快（1至2个主成分即可解释90%方差），而ProtT5_last1、ESM2_cls、ESM2_pooler和Ankh_last1收敛较慢（约需200个以上主成分），ChemBERTa约25个主成分达90%方差而MolFormer约需100个，表明不同语言模型衍生特征的内在维度和冗余度存在差异。在不同PLM-MLM组合性能与特征维度影响中，按平均R²汇总，ProtT5_last4_60在60主成分维度下表现最佳（R²=0.503），ProtT5_last4_20在20主成分维度下最佳（R²=0.493），MolFormer_cls_60（R²=0.489）和MolFormer_cls_20（R²=0.476）分别优于其他MLM表征；非对称组合评估显示20个分子主成分与60个蛋白质主成分组合取得最佳预测性能，表明分子嵌合在较低维度即达充分表征能力而蛋白质嵌合受益于更高维表征。在QM特征贡献中，基于选定配置进一步评估特征维度并引入QM描述符（在20 002条QM可用子集上），将蛋白质特征从60增至70显著改善性能而增至80无显著额外收益，分子特征±10变化无显著改善而减至10主成分导致性能下降，最终选定70个蛋白质主成分与20个分子主成分为最优配置；在所有受测维度下含QM描述符模型持续优于不含者（双侧配对t检验p=0.0084），独立训练-测试划分验证改善仍显著（p=0.0077），单特征添加分析显示分子硬度与软度带来最大个体改善，全部QM描述符合并改善更稳健。在模型对未见分子与蛋白质序列的泛化性评估中，含训练集未出现分子的样本预测行为与含已知分子样本相当，序列与训练集不完全相同的测试蛋白质预测精度与已知序列蛋白质相当，且序列一致性与预测性能间无明显相关性，表明模型性能并非主要依赖对已知分子或高度相似序列的记忆，而具有超越训练集化学与序列空间的泛化能力。

讨论部分总结如下：本研究系统考察了预训练蛋白质与分子语言模型表征对KM预测的适用性，揭示不同PLMs与MLMs以不同方式编码生化信息，部分解释其在下游KM预测中的效果差异。与现有最先进研究基准比较，2026年最新报道的顶级KM预测模型测试集R²=0.55略高于本研究模型（最佳平衡配置R²=0.537，最高整体精度R²=0.539），其他已发表单任务模型R²约0.50，但跨研究直接比较因数据集与训练/测试划分差异而固有受限；在公共Kroll基准数据集与KmPred研究相同训练/测试划分下，LM2KM测试集R²=0.509与KmPred（R²=0.51）相当，且该基准评估仅用PLM与MLM描述符而未含QM描述符（因基准数据集较大带来显著计算成本），故应视为完整LM2KM框架性能能力的保守估计。本研究关键发现是蛋白质与分子表征对KM预测贡献的非对称性，可能反映蛋白质序列信息在决定KM性质中涉及序列依赖的结构与催化背景的更大复杂性，提示设计酶动力学预测模型时应区别对待蛋白质与底物表征。QM描述符包括HOMO能量、LUMO能量、化学势、化学硬度、化学软度、亲电指数、给电子能力和受电子能力，从不同角度刻画分子电子性质并与化学反应性密切相关，为结构表征之外提供互补信息，其在所有受测特征配置中持续改善性能支持了数据驱动表征与物理描述符结合的价值。方法学上，重叠滑动窗口策略实现了超出当前PLMs输入长度限制的长蛋白质序列的有效编码，提升了框架的稳健性与泛化性。局限性方面，当前模型未显式捕捉酶-底物相互作用引起的KM变化或酶催化的详细机制，QM描述符并非直接表征KM的机制决定因素而旨在提供底物电子性质的互补信息；未来工作将探索更直接刻画酶-底物相互作用的描述符（如蛋白质-配体相互作用指纹）及代谢相关特征（如代谢位点（SOM）描述符和更精细的QM衍生性质），并通过多任务学习联合预测KM与K_cat以利用底物识别与催化周转间的共享信息进一步提升性能。此外，模型在酶工程与药物代谢研究中具有多种实际应用潜力，如通过按预测催化活性对酶排序辅助识别药物候选物的最可能代谢通路，以及通过纳入序列变体研究氨基酸突变对酶动力学的影响以识别增强催化活性或改变底物特异性的突变。