引言
核糖核酸（RNA）是生物制药领域中一种具有巨大潜力的生物活性分子，能够调节细胞命运和生化途径。信使RNA（mRNA）因其易于体外合成、快速制造和可控的成本而推动了基于RNA的基因疗法的发展。其免疫原性和安全性已在COVID-19疫苗中得到了充分验证[1], [2], [3], [4], [5], [6]。然而，mRNA容易受到核酸酶的降解，并且在细胞膜转运过程中存在障碍；因此，通常采用脂质纳米颗粒（LNPs）作为递送载体。LNPs主要由四类成分组成：可离子化的阳离子脂质、胆固醇、辅助磷脂和PEG化脂质，分别负责RNA的结合、颗粒结构的稳定、内吞作用的促进以及颗粒聚集的抑制。利用微流控混合技术，可以按预定义的比例组装mRNA和脂质，从而生成粒径均匀的mRNA-LNP疫苗制剂[7], [8], [9]。
疫苗的免疫原性和安全性直接取决于mRNA的含量、纯度、完整性和稳定性。mRNA剂量不足可能导致免疫反应较弱，而剂量过高则可能引发过度激活的免疫反应[10], [11]。同时，四种LNP脂质的摩尔比例、药物与脂质的比例、封装效率、粒径、颗粒稳定性以及细胞摄取能力之间存在密切关联。因此，在mRNA-LNP的研发和制造阶段，必须对mRNA含量和药物与脂质比例等关键指标进行严格的质量控制[12], [13], [14], [15], [16], [17]。
随着mRNA-LNP疫苗在传染病预防和免疫治疗中的应用不断扩大，全球监管机构相继发布了质量控制指南。世界卫生组织发布了针对RNA预防性疫苗的监管评估文件。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）规定了COVID-19 mRNA产品的mRNA完整性、杂质、粒径、药物与脂质比例及稳定性的控制要求。FDA随后发布的分析方法指南进一步指出，mRNA定量检测应满足准确性、重复性和灵敏度的要求[18], [19], [20], [21]。在中国，国家药品监督管理局（NMPA）通过《COVID-19疫苗预防性研究技术指南（试行）》等技术文件加强了mRNA疫苗的药品研究和质量控制，要求对mRNA和LNP成分进行全面的质量研究[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]。
可靠的分析方法为mRNA-LNP疫苗的质量控制奠定了基础[45], [46], [47]。mRNA定量面临多重技术挑战。mRNA具有5′-帽和poly (A)尾结构，结构复杂且易降解。碱基修饰可能会影响qPCR扩增效率并引入定量偏差。样品中的质粒DNA和宿主来源的RNA等杂质可能造成分析干扰。此外，mRNA对温度、pH值和核酸酶敏感，因此在样品预处理过程中容易发生降解。
LNP脂质组分的准确量化也颇具挑战性。四种脂质具有不同的理化性质，需要高效的分离策略。分离和测量封装态和游离态mRNA通常依赖于超滤和柱层析。粒径波动和系统稳定性问题会影响结果的重复性。分析方法需要具备足够的灵敏度和组分特异性，以便有效分离多种脂质分析物。
已报道的核酸定量技术包括RiboGreen检测[48]、液相色谱-质谱（LC-MS）[47]和高效液相色谱（HPLC）[49]。RiboGreen检测只能测定总核酸浓度[49]。对于基于LC-MS的检测方法，长链mRNA必须在LC-MS测量前被消化成短寡核苷酸片段；此外，这些方法的洗脱时间较长[47]。HPLC被广泛用于脂质和核酸的分离和定量[49]。然而，大多数报道的核酸分析研究侧重于色谱模式的优化[47], [49]，而忽视了金属离子与mRNA之间络合作用引起的污染效应，这会干扰定量结果。现有的脂质定量方法无法避免来自复杂基质的快速检测器污染，且每种脂质的线性校准曲线的相关系数（R2）仅超过0.99[50]。即使是一些同时测量脂质和核酸的方法，也主要关注检测的适用性和分离性能，对检测灵敏度的关注有限；相应地，它们对单个脂质的相关系数（R2）也仅略高于0.99[49]。
因此，迫切需要一个集成分析平台，能够专门量化复杂mRNA疫苗基质（含有mRNA、缓冲盐和其他成分）中的mRNA和脂质，并支持mRNA-LNP疫苗制剂的質量评估和工艺优化。
在本研究中，我们构建了一个结合了Bio-RP-HPLC-UV和UHPLC-ELSD的集成分析平台。传统的金属不锈钢LC系统被替换为生物相容的惰性液相色谱硬件，以减少吸附和污染现象。进一步优化了色谱条件，显著缩短了分析时间，提高了mRNA的定量精度和分析通量。在UHPLC-ELSD检测器前端安装了一个2/6端口阀门切换装置，以降低复杂LNP基质直接注入导致检测器快速污染的风险。进一步的色谱条件优化提高了LNP脂质检测的分辨率和灵敏度。验证结果显示，mRNA和每种脂质分析物的线性校准曲线的相关系数（R）均高于0.9990。mRNA的定量回收率在87.89%到100.31%之间，四种LNP脂质在三个浓度水平的平均回收率在99.52%到102.46%之间，性能优于以往报道的方法。该集成平台在实际应用于mRNA-LNP质量控制中表现出良好的优势。它可用于尺寸排阻色谱（SEC）纯化前后的样品表征，以及结合高通量动态光散射（DLS）获得的mRNA含量、药物与脂质比例和粒径数据的相关性分析。使用三个批次的制剂进行的检测验证显示了批次间的一致性。该平台实现了复杂mRNA疫苗基质中mRNA和脂质的专门量化，并在整个SEC纯化工作流程中实现了多属性参数的相互验证。它为建立此类疫苗制剂的简便实用的质量评估系统提供了技术支持。
