一种抗铁死亡的水凝胶增强了基于间充质干细胞球体的基因递送技术，从而有助于脊髓损伤的修复

《Journal of Controlled Release》：An anti-ferroptosis hydrogel enhances mesenchymal stem cell spheroid-based gene delivery for spinal cord injury repair

摘要

基于干细胞的基因输送系统是一种在脊髓损伤（SCI）后实现持续和局部治疗因子输送的有前景的方法。然而，这些系统的体内性能通常受到不利损伤微环境中移植物存活率低的限制。在这里，我们使用胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）作为代表性的治疗载荷，建立了一种基于间充质干细胞（MSC）球状体（MS）的GDNF基因输送系统（GF-MS）。值得注意的是，我们发现铁死亡（ferroptosis）是一个重要的、可靶向的限制造剂，它限制了SCI大鼠中移植物的持久性和转基因的表达，这一发现得到了与铁死亡相关通路转录组富集、线粒体损伤、亚铁积累、过度的脂质过氧化、SLC7A11/GPX4抗氧化防御机制受损以及植入的GF-MS中GDNF表达降低的支持。为了克服这一限制，我们构建了一种含有铁死亡抑制剂Fer-1的活性氧（ROS）清除水凝胶（RH-Fer），该水凝胶可以清除过量的微环境ROS并响应性地释放Fer-1。体内实验表明，RH-Fer有效减轻了铁死亡并延长了GF-MS的持久性。因此，这种结合系统在治疗窗口期间增强了局部GDNF的表达，促进了SCI大鼠的神经组织修复和功能恢复。这些发现突出了针对铁死亡的微环境调控作为优化基于干细胞的基因输送以修复SCI的有效策略。

引言

脊髓损伤（SCI）后的有效修复需要将治疗信号持续和局部地输送到损伤部位。然而，生物活性蛋白质或小分子药物的直接给药常常受到快速扩散、半衰期短、酶解作用以及在受伤脊髓中滞留能力差的限制[1]，[2]。这些限制使得难以维持稳定的局部治疗浓度，从而限制了治疗效果。因此，开发一种能够在原位产生并局部保留治疗因子的输送系统对于SCI修复具有重要意义。

近年来，间充质干细胞（MSCs）作为一种基于细胞的基因输送系统的平台而受到重视[3]。作为具有完整转录和翻译机制的活细胞，MSCs可以被基因工程改造为在原位稳定表达治疗基因并持续分泌功能性蛋白质[4]。此外，MSCs还具有内在的免疫调节和营养特性，可以部分缓解受伤脊髓中的炎症和氧化应激[5]。在我们之前的工作中，我们创建了不同大小的3D MSC球状体（MS），它们表现出增强的旁分泌效应[6]，[7]。与分散的单个细胞相比，MS可以直接植入损伤部位，减少细胞损失并改善局部滞留。MS的形成还规避了由于细胞-细胞外基质相互作用丧失而触发的程序性细胞死亡（PCD）形式[8]。这些特性使得MS成为SCI中局部和持续基因输送的理想干细胞平台。

在候选治疗基因中，胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）是SCI后神经修复的强大调节因子。通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路，GDNF促进神经元存活和轴突再生，这对于恢复轴突传导和运动功能至关重要[9]。重要的是，Anderson团队的最新研究表明，GDNF还作为化学吸引剂，引导再生的轴突朝向适当的目标区域，从而促进SCI后的神经回路重建[10]。因此，构建载有GDNF的MS（GF-MS）是一种实现SCI后持续和局部GDNF产生的有吸引力的方法。

尽管有这些优势，但有害的SCI微环境可能超出植入GF-MS的耐受范围，从而导致PCD并限制其植入效果[11]。值得注意的是，铁死亡是一种依赖铁的PCD形式，其特征是过度脂质过氧化，并且与SCI的病理进展密切相关。SCI后，出血产生的铁积累和持续的ROS产生 creates 了一个高度氧化和铁过载的环境。在这种条件下，富含多不饱和脂肪酸的膜磷脂极易发生脂质过氧化，从而引发铁死亡[12]。尽管在SCI后植入的MSCs中直接证明铁死亡的存在仍缺乏证据，但在其他具有类似铁和ROS富集微环境的病理条件下（包括败血症、心力衰竭和急性肝损伤）的研究中，已经确定铁死亡是限制体内植入MSCs存活和持久性的主要因素[13]，[14]，[15]。因此，铁死亡可能是阻碍GF-MS在SCI修复中实现GDNF基因输送和治疗效果的重要障碍。

在这项研究中，我们通过慢病毒转导和3D培养生成了载有GDNF的MS，以实现SCI损伤部位的局部和持续GDNF产生。通过转录组分析，我们发现植入的GF-MS中发生了铁死亡活化，表现为线粒体形态改变、亚铁（Fe²⁺）积累、丙二醛（MDA）升高、铁死亡相关蛋白质失调以及GDNF表达受损。此外，用Fer-1进行药理学干预证实了铁死亡在限制GF-MS存活和转基因表达中的作用。为了解决这一限制，我们进一步构建了含有铁死亡抑制剂Fer-1的ROS清除水凝胶（RH-Fer）来包裹和保护GF-MS（图1A）。具体来说，RH-Fer网络中的苯硼酸基团使水凝胶能够清除损伤微环境中的过量ROS，并响应性地释放Fer-1，从而减少脂质过氧化并抑制GF-MS的铁死亡[16]。改善的GF-MS存活期延长了局部GDNF的分泌，这与PI3K/Akt通路的激活和神经修复相关反应有关（图1B）。RH-Fer@GF-MS共同提供了抗铁死亡效应和神经营养支持，协同促进了SCI后的脊髓组织修复和功能恢复。

章节片段

材料

GDNF-lentivirus转导试剂盒从Genechem有限公司（中国上海）获得。GDNF ELISA试剂盒从Elabscience Biotechnology有限公司（中国武汉）获得。PVA、N、N、N′、N′-四甲基丙烷-1,3-二胺和4-(溴甲基)苯硼酸从Macklin公司（中国上海）购买。Fer-1、erastin和嘌呤霉素由MedChemExpress（中国上海）提供。Calcein AM、亚铁（Fe²⁺）检测试剂盒、MDA试剂盒和CCK-8试剂盒从Beyotime公司购买。

GF-MS实现了增强的局部GDNF基因输送并表现出促进的神经营养活性

MSCs逐渐被认为是可用于神经系统疾病中持续局部输送治疗基因的可植入修复细胞和活载体[3]，[18]。在这项研究中，使用了人脐带来源的MSCs，因为它们易于获取、安全性好、免疫原性低且增殖能力强，适用于临床前和临床研究[19]。我们使用编码GDNF和GFP的慢病毒载体对MSCs进行了转导

结论

总体而言，本研究确定铁死亡是影响移植MS存活和GDNF基因输送效率的重要因素。基于此，我们构建了一种抗铁死亡水凝胶（RH-Fer）来保护GF-MS免受铁死亡的影响并提高其治疗效果。RH-Fer有效清除了过量的ROS，并在氧化微环境中响应性地释放Fer-1，从而减少了LPO并延长了移植物的存活时间。因此，RH-Fer@GF-MS

CRediT作者贡献声明

李彦成：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取。王宇：可视化、研究。张勋奇：撰写——原始草稿、方法学。吴奇：可视化、软件。赵子茹：验证、研究。张芸婷：软件、方法学。高建清：监督、资金获取、概念化。曹建：撰写——审核与编辑、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了中国浙江省自然科学基金[LQZQN26H020003](J. C.)、衢州市科技项目[2025K004](J. C.)和[2022K57](Y. L.)、国家重点研发计划——干细胞与转化研究[2019YFA0112100和2019YFA0112102](J. G.)以及国家自然科学基金[81973252](J. G.)的支持。我们感谢Home for Researchers（www.home-for-researchers.com）在研究中的协助

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