Thymus quinquecostatus Celak.多酚通过抑制GRP78-ATF6-CHOP轴介导的内质网应激性凋亡减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤：网络药理学、分子对接与体内验证

《Journal of Functional Foods》：Pretreatment with polyphenols from Thymus quinquecostatus Celak. Attenuates endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis induced by myocardial ischemia/reperfusion in rats:An in vivo study combined with network pharmacology and molecular docking

原文未单列摘要；以下为论文亮点（Highlights）部分译文：网络药理学（network pharmacology）识别Thymus quinquecostatus Celak.多酚富集部位（TCPRF）抗心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）的候选靶点。分子对接（molecular docking）证实TCPRF与葡萄糖调节蛋白78（GRP78）具有高亲和力。TCPRF降低MIRI大鼠心肌损伤、梗死面积、肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）水平。TCPRF抑制MIRI大鼠中内质网应激（ERS）介导的凋亡。

研究背景与问题：心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）经济负担沉重，是重要公共卫生问题。心肌缺血是冠心病的核心病理环节，再灌注仍是临床标准治疗，但恢复血流可诱发心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI）。MIRI病理过程复杂，内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）可通过诱导心肌细胞凋亡参与其中，因此抑制ERS介导的凋亡被认为是抗MIRI的重要策略。天然膳食来源多酚具有较好的安全性和心血管保护活性。Thymus quinquecostatus Celak.具有食药两用历史，其多酚富集部位（polyphenol-rich fraction from Thymus quinquecostatus Celak., TCPRF）前期研究显示抗氧化、抗炎及减轻脑缺血再灌注和异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤的作用，但其能否调控MIRI中的ERS介导性心肌细胞凋亡尚不明确。该研究据此联合网络药理学、分子对接和体内实验进行预测与验证，为TCPRF作为功能性食品或营养品候选物提供机制依据。

方法概要：研究人员以HPLC-MS/MS和文献构建TCPRF成分集，SwissTargetPrediction预测靶点，GeneCards/OMIM获取MIRI靶点，MSigDB Hallmark、KEGG、Reactome和GO构建ERS基因集；STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，DAVID作GO/KEGG富集，Cytoscape筛枢纽靶点。采用GEO数据集GSE225105（Mus musculus，C57BL/6小鼠，I/R 24 h与sham各3例）行差异表达及人同源转换。分子对接使用HSPA5（PDB ID: 5E84）与JUN（PDB ID: 5FV8），AutoDock Vina计算结合能。雄性SD大鼠（6–8周，180–220 g）随机分为Sham、MIR、L-TCPRF 70、M-TCPRF 140、H-TCPRF 210 mg/kg和FDP 550 mg/kg组，灌胃7 d后行左前降支（left anterior descending, LAD）结扎45 min再灌注24 h；检测CK/LDH、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）和Western blot。

研究结果：
3.1 网络药理学分析揭示TCPRF调控MIRI中ERS的潜在机制：整合得到59个TCPRF化合物，获取2199个MIRI相关靶点、402个TCPRF预测靶点和428个ERS相关基因，三者交集22个靶点；化合物-靶点网络提示多靶点协同；GO富集涉及对ERS反应、ER未折叠蛋白反应、凋亡负调控和细胞缺氧反应；KEGG前15条涉及MAPK、Apoptosis、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、ER内蛋白加工、AMPK和JAK-STAT等通路。结论提示TCPRF可能经多靶点及ERS、凋亡相关通路发挥作用。
3.2 TCPRF调控MIRI中ERS的核心靶点识别：GSE225105经归一化和主成分分析后，鉴定740个小鼠差异表达基因并转换为人同源基因624个；与TCPRF靶点及ERS基因交集得HSPA5、JUN、HSPA1A；22个重叠靶点经11种拓扑算法筛出top10枢纽靶点（AKT1、JUN、NFE2L2、GSK3B、HSP5A、BCL2、SIRT1、TP53、BCL2L1、CCND1）；HSPA5和JUN同时出现在3个交集基因与top10枢纽靶点中，提示二者可能为核心靶点。
3.3 分子对接验证核心成分与关键靶点相互作用：所有核心成分与HSPA5结合能均低于?5.0 kcal/mol；前6个复合物可视化显示，Baicalein与HSPA5结合最强（?8.14 kcal/mol），主要与Gly455、Val453、Val490、Phe451等残基形成氢键和π-π堆叠；提示HSPA5可能是TCPRF治疗MIRI时调控ERS的更关键靶点。
3.4 TCPRF减轻大鼠LAD结扎诱导的MIRI：TTC示MIR组梗死面积显著增加，M-TCPRF、H-TCPRF和FDP显著降低，L-TCPRF仅呈降低趋势；H&E示MIR组肌原纤维排列紊乱、断裂坏死、炎性浸润和间质水肿，各TCPRF和FDP均可改善，H-TCPRF更优；血清CK、LDH在MIR组升高，TCPRF和FDP可降低。结论支持TCPRF预处理减轻心肌缺血性损伤。
3.5 TCPRF对MIR大鼠心肌凋亡的影响：TUNEL示MIR组阳性凋亡细胞增加，M-TCPRF、H-TCPRF和FDP显著减少；Western blot示MIR组Bax上调、Bcl-2及Bcl-2/Bax比值下降，H-TCPRF提高Bcl-2，各TCPRF和FDP降低Bax，M-TCPRF、H-TCPRF和FDP提高Bcl-2/Bax比值。结论为TCPRF可减轻MIRI诱导的心肌细胞凋亡。
3.6 TCPRF抑制MIRI诱导的ERS相关蛋白表达：Western blot示MIR组GRP78、活化转录因子6（activating transcription factor 6, ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）上调；M-TCPRF、H-TCPRF和FDP显著下调三者；L-TCPRF显著降低ATF6和CHOP，但GRP78无显著差异。结论为TCPRF可抑制ERS相关蛋白表达。

讨论总结：讨论指出梗死面积是急性心肌缺血预后的关键指标，减小梗死面积是心脏保护核心；TCPRF与阳性药FDP均降低梗死面积、CK/LDH并改善病理形态。网络药理学、公共数据集验证和分子对接共同识别GRP78（HSPA5）为关键枢纽靶点；9个核心活性成分中8个为本实验室已报道且主要为黄酮，既往证据支持黄酮经GRP78/CHOP等通路减轻ERS损伤。生理条件下GRP78与PERK、ATF6、IRE1结合并保持其失活，ERS时GRP78解离并启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）；持续或过度ERS转向促凋亡，CHOP是适应向凋亡转变的关键标志，涉及钙释放与caspase-12依赖凋亡、GADD34/PP1/eIF2α及抑制Bcl-2、上调Bax等机制，ATF6参与CHOP早期动态调控。该研究显示TCPRF降低GRP78、ATF6、CHOP，讨论并指出下游CHOP–caspase-12凋亡级联降低、Bcl-2/Bax恢复及凋亡受抑，提示GRP78–ATF6–CHOP轴可能参与保护。局限包括：TCPRF直接或间接调控GRP78尚不明确，需表面等离子共振及救援实验（H/R心肌细胞药理诱导/抑制ERS、siRNA敲低GRP78；体内tunicamycin或thapsigargin及GRP78敲低）；抗ERS凋亡指标可能是心脏保护附带现象，未测ROS/RNS或PI3K/AKT；未行超声LVEF/LVFS、Masson及cTnI/cTnT；所用剂量基于前期研究，不模拟日常膳食摄入，作为机制概念验证，尚需药代动力学、剂量反应和长期安全性研究。

研究结论翻译：天然植物和食物来源的多酚具有多样生物活性并对人类健康有显著益处。近年来，越来越多研究关注不同Thymus物种富含酚类提取物的生物活性及其在食品、化妆品和医药等多个行业中的潜在应用。基于既往发现，该研究整合网络药理学预测、GEO数据集验证和分子对接分析，系统阐明TCPRF通过调控ERS改善MIRI的潜在分子机制，并确定GRP78为关键枢纽靶点。与此一致，体内实验证实TCPRF显著减轻心肌缺血/再灌注大鼠ERS介导的心肌细胞凋亡。该研究初步提示，TCPRF处理可能与ERS启动和早期UPR阶段减弱相关，并对CHOP–caspase-12凋亡级联产生继发性抑制。总体而言，这些结果为支持Thymus quinquecostatus Celak.在预防MIRI中的潜在应用提供实验证据，并为进一步研究其治疗机制提供依据。