《Journal of Molecular Biology》：DAXX maintains chromosomal stability by keeping methylation levels at specific repetitive elements
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DAXX通过将特定重复元件（repetitive elements, REs）处的甲基化水平维持在一定范围，从而维持染色体稳定性。
在染色体不稳定性（chromosomal instability, CIN）稳定型HCT116细胞中敲低DAXX可增加微核（mi
DAXX通过将特定重复元件（repetitive elements, REs）处的甲基化水平维持在一定范围，从而维持染色体稳定性。
在染色体不稳定性（chromosomal instability, CIN）稳定型HCT116细胞中敲低DAXX可增加微核（micronuclei）形成。
DAXX通过支持DNA甲基化维持异染色质（heterochromatin）抑制状态。
DAXX缺失导致REs异常表达，包括LTR7Y亚家族。
DAXX通过调控异染色质和沉默重复元件对基因组稳定性至关重要。
研究背景与问题：染色体不稳定性（chromosomal instability, CIN）存在于约90%的实体瘤和血液恶性肿瘤中，表现为细胞分裂过程中结构性及数目性染色体异常，包括滞后染色体、染色体桥、微核（micronuclei, MN）、非整倍体及多倍体。除细胞周期基因突变外，以转录抑制和重复元件（repetitive elements, REs）富集为特征的结构性异染色质维持，对防止CIN具有重要作用。DAXX（death domain-associated protein 6）作为分子伴侣，在异染色质区沉积复制非依赖性组蛋白变体H3.3，并与H3.3、H3K9me3、H4K20me3及DNA甲基化/异染色质相关机器相互作用。DNA甲基化是异染色质维持机制之一，DNMTs可与DAXX及ATRX相互作用；DNMT1可由DAXX招募至RelB靶位点启动子并产生协同抑制。在小鼠胚胎干细胞中，早期胚胎整体DNA去甲基化时，DAXX/ATRX通过维持和促进H3K9me3防止IAP及端粒等重复元件去抑制。部分REs作为转座元件可插入基因组，发挥顺式调控作用或破坏基因，因此需严格沉默；DAXX定位至这些位点及DNA甲基化均参与其沉默。然而，DAXX缺失是否足以导致重复元件去甲基化并产生CIN尚不清楚，且DAXX在该模型中调控的具体重复家族未知，因此研究人员在无CIN的结直肠癌（colorectal cancer, CRC）细胞系HCT116中降低DAXX水平，检验其是否促进CIN。
研究人员开展的研究、结论及意义：研究人员在染色体稳定的HCT116细胞中敲低DAXX，采用微核试验检测CIN，采用甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP）检测特定重复元件DNA甲基化，并通过RNA-seq分析重复元件表达。结果显示，DAXX敲低增加MN形成，并伴随着丝粒、近着丝粒及端粒重复元件位点低甲基化和LTR7Y亚家族去抑制。研究结论表明，DAXX通过维持特定重复元件位点DNA甲基化并沉默LTR7Y等重复元件，帮助维持染色体稳定性；该研究将DAXX依赖的选择性重复元件沉默与CIN联系起来，并提出LTR7Y去抑制是否可促进结直肠癌CIN的问题。
关键技术方法：研究人员使用HCT116、SW626、PCS-200-010（HEKn）、OVCAR3和SKOV3等细胞系，其中HCT116为CIN稳定型结直肠癌细胞系。方法包括qPCR、Western blot、siRNA转染、微核试验、pan-centromeric荧光原位杂交（FISH）、MeDIP、RNA-seq及两种重复元件定量分析流程（STAR/TElocal与SalmonTE/Repbase），并以Student’s t检验、方差分析和两样本比例Z检验进行统计。
研究结果：（1）CIN status of different cell lines does not affect DAXX abundance（不同细胞系CIN状态不影响DAXX丰度）：通过比较不同CIN状态细胞系的DAXX RNA和蛋白水平，发现内源性DAXX水平与CIN状态无关，随后选择染色体稳定、近二倍体核型的HCT116；筛选siRNA后，siRNA3与siRNA4组合使DAXX表达降低约70%。（2）Loss of DAXX induces CIN, and this effect is enhanced by inhibition of DNA methylation（DAXX缺失诱导CIN，且DNA甲基化抑制增强该效应）：微核试验显示，DAXX敲低在48 h增加MN但差异不显著，在72 h显著增加MN；DAC处理使MN数量增加，尤其5 μM时明显；pan-centromeric FISH显示CEN?和CEN+ MN频率均增加，表明DAXX降低足以增加MN频率并可能导致CIN。（3）DNA methylation levels are particularly affected at centromeres, pericentromeres and telomeres following DAXX knockdown（DAXX敲低后DNA甲基化水平尤其影响着丝粒、近着丝粒和端粒）：72 h MeDIP显示，DAXX敲低显著降低着丝粒α卫星、近着丝粒卫星2及X染色体短臂端粒的DNA甲基化；LINE-1无显著低甲基化；ELISA显示整体DNA甲基化未受影响，提示DAXX在特定异染色质位点维持DNA甲基化。（4）DAXX represses LTR7Ys elements in unperturbed cells（DAXX在未扰动细胞中抑制LTR7Y元件）：RNA-seq两种分析流程均显示DAXX敲低后REs去抑制，且LTR7Y为两流程一致显著上调的重复元件；RT-qPCR验证多个LTR7Y拷贝（dup204、dup10、dup165）表达上调；在DAXX敲除的胶质母细胞瘤细胞系中亦观察到LTR7Y上调，提示该调控并非HCT116细胞类型特异。
讨论总结：研究指出，不同癌细胞系中DAXX丰度相似，DAXX丰度本身不决定CIN状态。在胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrine tumors, PanNETs）中约43%肿瘤携带ATRX或DAXX功能缺失突变，DAXX缺失与CIN及较差预后相关；HCT116无DAXX突变或拷贝数变异（copy number variations, CNVs）。DAXX敲低诱导MN且随时间累积，72 h较对照增加约60%；DAC在DAXX敲低细胞中未产生协同效应，原文认为可能与并非所有计数细胞均降低DAXX、DAXX敲低降低细胞活力或细胞激活补偿机制有关，未来可用CRISPR-Cas9等非瞬态方法克服。DAXX敲低降低α卫星、卫星II及Xp端粒等特定位点DNA甲基化，而整体甲基化不变，说明DAXX并非同等调控所有重复元件，而是维持部分异染色质位点DNA甲基化；这与小鼠精子发生中DAXX通过H3K9me3沉积沉默年轻LINE-1的观察一致。分化体细胞中H3K9me3与DNA甲基化紧密互作，提示DAXX缺失可能破坏其正常作用区域的两种抑制性标记；部分REs可能不依赖DAXX，而DAC全基因组抑制DNA甲基化，故DAC后整体甲基化下降大于DAXX敲低。RNA-seq显示差异表达REs多为LTR类，LTR7Y在独立分析和额外癌症模型中一致上调，提示其去抑制可能是DAXX缺陷的一般后果而非细胞类型特异事件；去抑制重复元件可通过异常转录、新插入及异染色质组织丧失促进基因组不稳定，LTR7Y过表达可能与CIN表型相关，但该相关性未建立因果关系。LTR7Y与HERVH常共同转座，二者在敲低条件下均上调，可能共调控或属于同一转录单元/调控网络，尚需研究。LTR7Y在多种癌症包括结直肠癌中过表达，可区分正常结肠与结直肠癌，并在原发瘤和肝转移中保持升高；本研究表明DAXX是LTR7Y表达的调控因子。
研究结论翻译：总之，染色体稳定性部分依赖于适当的异染色质维持和重复元件抑制。DAXX缺失足以在染色体稳定的结直肠癌细胞中诱导染色体错误分离，并伴随着丝粒、近着丝粒和端粒重复元件的位点特异性低甲基化及LTR7Y去抑制。这些发现提示，DAXX依赖的选择性重复元件沉默是一种有助于维持染色体稳定性的机制，并提出LTR7Y去抑制是否可在结直肠癌中促进CIN这一待研究问题。
