整合遗传与单细胞分析揭示巨噬细胞介导衰老与骨质疏松关联及TGFB1/HNRNPUL1调控轴

《Aging Cell》：Integrative Genetic and Single-Cell Analysis Reveals Macrophages as Key Mediators Linking Aging and Osteoporosis

　　

骨质疏松症是一种高度流行的年龄相关疾病，越来越多证据提示其并非孤立发生，而是与衰老过程内在相关。研究人员采用整合性方法系统识别衰老与骨质疏松症之间的关系，并揭示介导该关联的关键细胞类型和分子调控因子。对UK Biobank表型数据的观察性分析及对汇总水平统计数据的孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）分析显示，衰老与骨质疏松症相互关联，互为因果。通过将全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）数据与全面组装的骨重塑单细胞转录组图谱（single-cell transcriptomic atlas）整合，研究人员确定巨噬细胞为介导该关联的关键细胞类型；并且骨髓来源巨噬细胞百分比随年龄下降。此外，研究人员采用共享遗传工具和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）揭示该交互作用下的新分子调控因子。研究人员确定TGFB1和一个新基因HNRNPUL1是影响巨噬细胞分化和功能的关键调控因子。总之，该研究为衰老与骨质疏松症之间的双向关系提供了观察性和遗传学证据，并揭示由TGFB1和HNRNPUL1调控的以巨噬细胞为中心的机制，为年龄相关骨丢失提供新见解。

研究背景：骨质疏松症是以骨密度（bone mineral density, BMD）下降和骨微结构恶化、骨折风险增加为特征的常见骨骼疾病，衰老是其重要致病因素。骨重塑依赖成骨细胞与破骨细胞间的动态平衡；衰老可使该平衡向骨吸收偏移，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）衰老后增殖与分化改变并偏向脂肪谱系，衰老免疫细胞等分泌因子在骨髓积累。另一方面，骨质疏松这一局部紊乱也可能加速全身衰老，如骨髓骨细胞条件敲除导致小鼠骨质疏松并缩短寿命，年轻骨细胞来源胞外囊泡可改善APP/PS1小鼠认知损害，骨重塑代谢亦影响全身代谢，提示二者可能存在双向因果。现有研究多分别关注衰老或骨质疏松；GWAS汇总数据可分别表征骨质疏松（跟骨定量超声估计BMD，eBMD；骨折风险）和衰老（GrimAge、mvAge），MR、LDSC及共享遗传工具可在系统层面同时研究二者。将GWAS与单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）整合有助于识别性状相关细胞类型，但骨衰老研究受限于缺乏涵盖骨重塑全部细胞类型的综合单细胞图谱；成骨细胞、破骨细胞相对稀少，破骨细胞为单核/巨噬细胞融合形成的大型多核细胞，技术捕获困难。因此，研究人员开展整合遗传与单细胞分析，以系统解析衰老与骨质疏松的因果关系及关键细胞和分子调控因子。
研究人员开展的研究及结论：该研究结合UK Biobank个体表型数据与GWAS汇总统计，采用观察性分析、MR、单细胞图谱整合、单细胞GWAS（scGWAS）、单细胞WGCNA（scWGCNA）、细胞通讯、共享遗传与共定位分析等，得出衰老与骨质疏松存在双向因果关系，巨噬细胞是连接二者的关键细胞类型，TGFB1和HNRNPUL1是影响巨噬细胞分化与功能的关键调控因子。其意义在于为年龄相关骨丢失提供观察性和遗传学证据，并揭示以巨噬细胞为中心、由TGFB1和HNRNPUL1调控的机制及潜在治疗靶点。
关键方法（不超过250字）：研究使用UK Biobank个体表型队列（初始439,982人，保留278,164名具有跟骨BMD、骨折状态和年龄完整信息者）；骨质疏松GWAS汇总数据来自GEFOS（eBMD 426,824名欧洲样本；骨折等），衰老汇总数据为GrimAge（34,710名欧洲参与者）和mvAge（有效样本量约190万欧洲参与者）；cis-eQTL来自eQTLGen。单细胞数据包括小鼠骨髓微环境、破骨细胞生成、不同年龄小鼠骨髓、异时共生及人骨髓转录组数据集。方法包括广义相加模型、Kaplan–Meier/Cox分析、MR及敏感性分析、scVI/scANVI整合、scGWAS、scWGCNA、CellPhoneDB、conjFDR、SUPERGNOVA、共定位、虚拟敲除及RNA-蛋白结合预测/CLIP数据库验证。
研究结果：
3.1 衰老与BMD/骨折之间的双向关系：基于UK Biobank表型的广义相加模型显示，两性跟骨BMD随年龄下降，女性50岁后下降加速；Cox回归显示有骨折史或较低跟骨BMD者生存率降低。MR的逆方差加权、加权中位数和MR-PRESSO结果一致支持显著双向因果：遗传决定GrimAge较高与较低eBMD及较高骨折风险相关，mvAge（抗衰老）与较低骨折风险相关；遗传决定骨折影响GrimAge和mvAge，较高eBMD与较低GrimAge相关。敏感性分析未见显著异质性或水平多效性，留一法无单个SNP显著改变估计。
3.2 巨噬细胞是BMD和衰老易感性的关键细胞类型：研究人员整合骨髓微环境与破骨细胞生成两套scRNA-seq数据，采用变分自编码器无监督学习和scANVI半监督细化，共享B细胞和中性粒细胞有效共聚类，破骨细胞与其祖单核细胞对齐；与传统ComBat、Harmony相比，深度学习方法更能合并数据。scGWAS显示MSCs、成骨细胞、软骨细胞和巨噬细胞与eBMD相关，破骨细胞和巨噬细胞与衰老相关，巨噬细胞同时涉及二者。eBMD相关模块含CTSB和TGFB1，衰老相关模块含APOE和TGFB1；细胞通讯显示巨噬细胞与软骨细胞、MSCs存在广泛配体-受体互作。人骨髓scGWAS验证巨噬细胞与mvAge关联最强、成骨细胞与eBMD关联最强，支持巨噬细胞的桥梁作用。
3.3 衰老中的巨噬细胞重塑、表观遗传改变和细胞通讯扰动：分析两套不同年龄小鼠骨髓scRNA-seq数据，骨髓细胞以免疫来源为主，但巨噬细胞占比较小，且其比例随年龄显著下降。巨噬细胞再聚类为IFN刺激、增殖、MHC-II⁺、脂质相关和炎症5个亚群；脂质相关亚群随年龄增加，IFN刺激和炎症亚群下降，MHC-II⁺亚群在晚年（18–24月）增加；scGWAS提示MHC-II⁺巨噬细胞与eBMD和mvAge相关。scWGCNA基于metacell识别22个模块，其中Gainsboro模块（171个基因）与巨噬细胞比例最强正相关、与年龄负相关；GO富集显示转录调控、染色质重塑和细胞信号，表观遗传调控最显著，BRD2、PSME4、BAZ2A、ZZEF1与赖氨酸乙酰化组蛋白及乙酰化依赖蛋白结合相关。以Gainsboro模块基因进行细胞通讯分析，TGF-β通路和血管性血友病因子（von Willebrand Factor, VWF）复合物为潜在互作，提示TGF-β和VWF可能介导巨噬细胞在骨髓微环境中的年龄相关信号。
3.4 BMD与衰老的共享遗传结构：条件QQ图显示eBMD相关SNP随mvAge关联增强而富集；联合错误发现率（conjFDR）分析识别约160个同时与两表型显著相关的SNP；局部遗传相关分析显示其中20个SNP所在染色体区域存在eBMD与mvAge多基因重叠。eQTL映射将20个SNP链接至43个基因，HNRNPUL1是唯一与Gainsboro模块重叠的基因；ccFDR显著SNP rs12975920位于HNRNPUL1基因体，且HNRNPUL1与TGFB1染色体物理位置邻近。HNRNPUL1基因体内或eQTL显著SNP与eBMD强关联；以HNRNPUL1表达相关SNP为工具变量的MR支持HNRNPUL1表达与衰老表型存在因果关联；共定位分析显示共享因果变异后验概率PP.H4>0.8，提示该关联由HNRNPUL1表达调控介导。
3.5 TGFB1和HNRNPUL1在巨噬细胞功能和破骨细胞分化中的潜在作用：研究人员从整合图谱中选取破骨分化相关细胞，基于ACP5、MMP9和CTSK表达计算破骨分化评分，评分随分化升高，验证图谱可靠性；TGFB1和HNRNPUL1表达随巨噬细胞分化下降，提示二者可能调控巨噬细胞命运并影响破骨生成。以M1/M2标志评分，HNRNPUL1或TGFB1表达与经典M1/M2极化无显著相关，亦无亚群独占M1或M2特征；但二者与“增殖”和“MHC-II⁺”巨噬细胞亚群强相关，而这些亚群标志与年龄无显著相关。虚拟敲除显示两基因互不显著影响对方表达；HNRNPUL1编码RNA结合蛋白，计算预测其与TGFBs mRNA具有高结合潜力（评分>0.5），并获CLIP数据库佐证，提示HNRNPUL1可能调控TGFBs RNA剪接，形成HNRNPUL1-TGFB信号轴影响巨噬细胞命运和功能。
讨论部分总结：讨论指出，随着人口老龄化，理解骨衰老机制至关重要；该研究以个体表型回归和GWAS汇总MR分析佐证衰老与骨质疏松的双向因果，提示防治骨质疏松可能有助于延缓全身衰老，并强调需研究连接二者的细胞类型和基因。巨噬细胞作为先天免疫关键成分，随年龄出现持续促炎状态和功能衰退；经典M1/M2二分法不足以概括其异质性。研究将巨噬细胞分为5个亚群，MHC-II⁺巨噬细胞与骨衰老及HNRNPUL1、TGFB1表达相关；该亚群在高风险薄纤维帽纤维粥样斑块中亦富集，提示靶向抗原呈递巨噬细胞可能具有治疗骨衰老和预防急性心血管事件的潜在双用途。TGFB1和HNRNPUL1为19号染色体上相邻基因，呈协调的年龄相关表达，可能通过巨噬细胞介导机制共同调控骨衰老；TGFB1是骨基质主要细胞因子，可促进骨重塑和骨髓基质细胞迁移，TGF-β信号亦与全身衰老、慢性炎症和纤维化相关，但其直接桥接衰老与骨质疏松的作用尚未充分阐明；HNRNPUL1为参与DNA损伤应答（通过招募NBS1）的RNA结合蛋白，MR和共定位分析显示其对衰老有因果效应，斑马鱼Hnrnpul1突变体表现骨骼缺陷，且其作为剪接因子被预测结合TGFB mRNA，形成HNRNPUL1-TGFB1轴调控巨噬细胞功能和骨衰老。局限包括：采用sc-eQTL分析可增强观察效度，但骨组织公开sc-eQTL数据缺乏；捕获巨噬细胞数量有限，限制更深亚群解析；HNRNPUL1-TGFB1轴的功能作用仍需实验验证。研究结论翻译：总之，该研究提供了衰老与骨质疏松症之间双向因果联系的遗传学证据，并揭示由TGFB1和HNRNPUL1调控的以巨噬细胞为中心的机制。总体而言，这些发现为年龄相关骨丢失提供了新视角和潜在治疗靶点。