《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Metabolomics Reveals Multiple Metabolic Alterations and Biomarkers of Disease Severity in Facioscapulohumeral Muscle Dystrophy
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背景：面肩肱型肌营养不良症1型（FSHD1）是最常见的成人起病肌病之一，其病因与4号染色体上D4Z4巨卫星重复序列阵列的缩短存在因果关联。该病表现为面部、肩带及下肢进行性肌无力的可变模式。其病理生理机制尚未被完全阐明，且目前尚无有效治疗手段。此外，缺乏经过验证
背景：面肩肱型肌营养不良症1型（FSHD1）是最常见的成人起病肌病之一，其病因与4号染色体上D4Z4巨卫星重复序列阵列的缩短存在因果关联。该病表现为面部、肩带及下肢进行性肌无力的可变模式。其病理生理机制尚未被完全阐明，且目前尚无有效治疗手段。此外，缺乏经过验证的生物标志物限制了临床试验中对疾病进展和治疗效果的评估。代谢功能障碍曾被假设为促发因素，但相关研究仍十分有限。
方法：在这项多中心、观察性、横断面病例对照研究中，研究人员采用质谱技术对57例轻至中度面肩肱型肌营养不良症患者（年龄：41.8 ± 11.9岁；女性/男性比值：1.04；FSHD临床评分6.4 ± 2.6）以及年龄和性别可比的对照者（年龄：41.1 ± 11.2岁；女性/男性比值：1.13）进行了定量血浆代谢组学分析，受试者来自三家三级神经肌肉疾病参考中心。研究将纳入范围限制于保留行走能力的患者，以更好地捕捉并非主要由晚期残疾驱动的全身性代谢改变。研究人员采用结合单变量和多变量分析以及五种机器学习分类器的整合框架对数据进行分析。
结果：研究识别出57种可区分患者与对照者的循环代谢物，提示一氧化氮代谢、线粒体代谢与一碳代谢，以及氧化应激、肌肉量维持和脂质膜重塑等方面存在系统性紊乱。值得注意的是，肌酸酐降低（患者与对照者的倍数变化：0.754；FDR校正p = 0.000003）和不对称二甲基精氨酸（ADMA）升高（患者与对照者的倍数变化：1.168；FDR校正p = 0.000704）是最显著的改变代谢物，二者均与临床神经肌肉功能评分呈强相关，包括肌力（肌酸酐ρ = 0.62，p = 0.0001；ADMA ρ = 0.34，p = 0.0124）、面肩肱型肌营养不良症严重程度评分（肌酸酐ρ = 0.53，p = 0.0001；ADMA ρ = 0.32，p = 0.0145）以及日常活动受限ACTIVLIM量表（肌酸酐ρ = 0.38，p = 0.0035；ADMA ρ = 0.35，p = 0.008）。常用于支持线粒体疾病诊断的生物标志物GDF15血浆水平在患者中较对照者轻度但显著升高（542.3 pg/mL ± 277.2 对 444.4 pg/mL ± 164.5，p = 0.043）。对预设的线粒体相关代谢物组合的进一步分析显示，涉及线粒体代谢通路的协同改变可区分FSHD1患者与对照者（最佳AUC = 0.83）。
结论：上述发现凸显了在面肩肱型肌营养不良症轻至中度阶段即可检测到的全身性代谢紊乱，确定肌酸酐和ADMA为有前景的疾病严重程度生物标志物，并拓展了当前对该病病理生理学的认识。
临床试验注册：ClinicalTrials.gov标识符：NCT06086548
面肩肱型肌营养不良症（FSHD）是成人群体中最常见的遗传性肌病之一，报告患病率约为1/12 000，典型表现为青年期起病的面部、肩带及下肢肌无力，非典型表型亦日益被认识。其中最常见的1型（FSHD1）与4q35区4号染色体亚端粒区D4Z4巨卫星重复序列缩短相关，但超过2%的普通人群携带缩短的D4Z4重复及允许性4号染色体单倍型而无任何疾病表现，提示其发病机制为复杂的多因素过程。研究最深入的机制之一涉及D4Z4位点附近通常沉默的转录因子DUX4的遗传去抑制，其可诱导肌生成抑制与凋亡；然而DUX4在FSHD患者肌肉活检中表达低且呈散发性，甚至在受累肌肉中常无法检出。目前已描述若干下游分子改变，包括PAX7失调及lncRNA介导的对蛋白合成的影响。由于分子发病机制认识不完整，且缺乏可靠、易获取的生物标志物以加速药物开发早期阶段，该病目前尚无可用治疗。下游致病机制可能参与疾病表现度与进展，但迄今研究甚少；近期自上而下的RNA测序提示氧化应激和线粒体功能障碍参与FSHD1。骨骼肌是人体最丰富的组织，可主动分泌多种具有自分泌和内分泌效应的分子，对骨骼肌及全身稳态均十分重要。基于此，研究人员假设分泌组和代谢改变可能对理解潜在的可干预下游机制及识别无创生物标志物具有重要意义，为此在表型刻画深入的轻至中度FSHD1患者队列及年龄性别分布相似的健康对照队列中开展高通量血浆代谢组学分析，以确定疾病早期是否可检测到显著代谢改变；通过质谱生成高通量代谢谱，并采用包括统计建模和机器学习在内的先进计算方法进行分析，同时补充分析线粒体因子GDF15——一种属转化生长因子β超家族、在响应线粒体功能障碍时释放入循环的激素。结果揭示了广泛的代谢改变及两个与FSHD1患者临床严重程度相关的候选生物标志物。
研究共纳入2024年第一、二季度在法国昂热大学医院、意大利摩德纳-雷焦艾米利亚大学及那不勒斯费德里科二世大学三家三级神经肌肉疾病参考中心接受常规检查的门诊FSHD1患者57例（男28例、女29例），并同期招募年龄（±5岁）和性别相似的健康对照者64例（女34例、男30例），要求采血时至少空腹8 h。患者纳入标准为：年龄18~60岁；FSHD1分子诊断（D4Z4重复单元数<11）；典型FSHD临床特征且至少存在面部、肩带和/或骨盆带轻度受累（肩带和/或骨盆带至少一块肌肉MRC评级≤4/5）；FSHD评分4~10分的轻至中度疾病严重程度；保留行走能力（允许使用手杖）。患者与健康对照者的排除标准包括：存在与FSHD无关的严重系统性疾病、酒精或有毒物质滥用、未控制的代谢性疾病（如糖尿病或甲状腺功能减退）、妊娠或哺乳。神经肌肉评估由神经肌肉疾病专科神经科医师完成，包括MRC肌力评估、10 m步行试验、ACTIVLIM日常活动受限量表及FSHD综合临床评估表（CCEF）；MRC总分按21块肌肉（4块轴向肌、3块肩带肌、6块上肢肌、4块骨盆带肌、4块下肢肌）的单个MRC评分之和计算，肢体肌力双侧评估。外周血采集于至少8 h过夜空腹后置入肝素钠管，冰上转运至当地实验室，于+4°C、2300 g离心10 min，血浆分装后?80°C保存；摩德纳与那不勒斯样本干冰运输至法国昂热大学医院，与当地样本合并保存于该院生物资源中心生物样本库（BB-0033-00038），溶血样本被排除。靶向定量代谢组学采用MxP Quant 500 XL试剂盒（Biocrates Life Sciences AG）结合QTRAP 5500质谱仪（SCIEX）和Agilent 1260 HPLC系统，可同时定量1019种代谢物（107种极性化合物和912种脂质），并计算474种预设代谢物和与比值；分析流程结合流动注射分析串联质谱（FIA–MS/MS，用于非极性代谢物）与液相色谱串联质谱（LC–MS/MS，用于极性化合物），样本在微板中随机分布以避免残留效应，数据采集使用Analyst软件（SCIEX），峰检测、鉴定与定量使用MetIDQ软件（Biocrates），定量基于校准标准品和内标质控。血浆GDF15采用ELISA试剂盒（Human GDF-15 ELISA Kit，R&D Systems）在Clariostar酶标仪（BMG Labtech）上测定，每板设内部质控，样本与质控均双份测定，超过检测上限的样本以1/2稀释复测。数据处理中仅纳入符合准确度和精密度标准（变异系数<20%）的代谢物，缺失值>20%者剔除，其余缺失值以K近邻算法填补，数据经均值中心化、单位方差缩放和对数转换；组间单变量比较采用非参数Mann–Whitney U检验，Benjamini–Hochberg法进行多重检验校正，校正p<0.05为有统计学意义，但为丰富生物学解释和便于跨方法比较，保留了显著性最强（p<0.01）而未通过错误发现率（FDR）校正的代谢物；多变量、机器学习方法及代谢通路分析详见支持信息。
3.1 参与者人口学特征与FSHD队列表型特征：为辨别FSHD1早期代谢改变，研究人员招募57例轻至中度患者与63例年龄性别可比的健康对照者；1份样本因血浆溶血被排除；两组人口学与人体测量学数据无显著差异；发病年龄、D4Z4重复数、轻度升高的肌酸激酶（CK）水平及CCEF临床分类均符合典型FSHD1病例；仅1例归入D1类，该患者具典型FSHD表现并在严重胸椎后凸背景下出现肩外展受损而无翼状肩胛；FSHD临床严重程度评分、肌力评估、10 m步行试验及ACTIVLIM量表均符合轻至中度FSHD严重程度。
3.2 代谢组学分析：在分析的1019种代谢物中，678种被认为可可靠定量；基于三个参与中心的无监督主成分分析（PCA）未显示聚类，提示采样流程标准化良好；基于病例与对照状态的PCA未见组间自发聚类，并识别出病例中1个离群样本，该样本在后续分析中被排除。单变量分析仅考虑浓度变化>10%且p<0.01者，识别出21种浓度变化的代谢物，其中5种经FDR校正后仍显著；最显著的变化包括肌酸酐下降25%（FDR校正p = 2.97e-06）、不对称二甲基精氨酸（ADMA）升高17%（FDR校正p = 7.04e-04）、组氨酸下降9%（FDR校正p = 0.003）、天冬酰胺下降12%（FDR校正p = 0.029）及乳酸升高32%（FDR校正p = 0.046）。为评估区分两组的整体代谢特征，研究人员应用包括正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和五种机器学习方法在内的多变量计算模型；OPLS-DA监督多变量分析显示基于代谢谱区分病例与对照的稳健预测模型（Q2Y(cum) = 0.58），交叉验证方差分析（CV-ANOVA，p = 1.605e-18）及置换检验（Perm R2为0.352，低于0.4阈值）表明过拟合风险低；40种代谢物变量投影重要性（VIP）评分>1，对模型贡献最大；该多变量特征证实肌酸酐、ADMA、组氨酸、天冬酰胺和乳酸的判别力，并突出皮质醇降低及胆碱、谷氨酸、鸟氨酸升高，以及甘油三酯和磷脂水平的改变。五种算法的机器学习分析显示，基于代谢特征的病例/对照分类具预测能力，所有模型曲线下面积（AUC）>0.7，以Lasso算法表现最佳（AUC = 0.83）；SHAP值分析识别出21种对Lasso模型有贡献的关键代谢物，再次突出肌酸酐、ADMA、组氨酸、胆碱和皮质醇及若干脂质种类。维恩图展示不同分析方法的代谢物重叠，被三种或两种方法识别者被认为最稳健。研究人员进一步分析Biocrates提出的400种和与比值，发现病例较对照有14种和或比值经FDR校正后显著改变，多数与ADMA、胆碱、鸟氨酸、乳酸和谷氨酸等判别代谢物直接或间接相关，揭示一氧化氮生物合成、一碳代谢相关酶、肌肉蛋白降解、炎症及线粒体功能（乳酸/己糖、谷氨酸/谷氨酰胺、甘氨酸/丝氨酸）等多方面代谢功能紊乱；后者与患者乳酸升高相结合，一致提示FSHD1存在线粒体功能障碍。为获得支持该假设的独立证据，研究人员定量循环GDF15，观察到患者较对照显著升高（542.3 ± 277.2 对 444.4 ± 164.5，p = 0.043）。通路富集分析采用预设的文献衍生线粒体相关代谢物组合，发现多个通路显著富集，尤以丙酮酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸代谢，一碳代谢，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢为著；基于该线粒体相关代谢物组合的监督机器学习模型中，岭回归分类性能最佳，平均交叉验证AUC为0.833 ± 0.08，其次为弹性网络、支持向量机、Lasso、随机森林和XGBoost，表明该线粒体相关代谢物子集可较好区分FSHD1患者与对照者。总体而言，FSHD1代谢改变的功能分类凸显线粒体代谢、氧化应激、一氧化氮生物合成、一碳代谢、肌肉量稳态和膜重塑等多个相互关联生物学过程的紊乱。
3.3 肌酸酐与ADMA血浆水平与多项FSHD疾病严重程度临床指标的相关性：临床有用的生物标志物应能反映疾病严重程度以客观监测疾病进展，而FSHD目前尚无此类标志物。为识别疾病严重程度的候选生物标志物，研究人员对最具判别力的代谢物与三项独立、经验证且临床相关的神经肌肉功能指标进行相关性分析，发现血浆肌酸酐和ADMA水平与全部三项功能评分显著相关，据此认为二者与FSHD1疾病严重程度显著相关。
讨论部分指出，既往以代谢组学评估FSHD代谢功能的研究较少，两项研究在包含小样本FSHD1患者的不同肌肉疾病队列中进行，报告的显著变化有限，且缺乏详细临床表型刻画及与疾病严重程度的相关性分析。本研究纳入表型刻画深入的大样本FSHD1患者及年龄性别分布相似的对照者，重点聚焦中度受累患者，以捕捉反映疾病早期激活的致病机制而非晚期肌肉变性继发后果的代谢改变；多中心性质增强结果的稳健性和可推广性，减轻局部偏倚并实现跨独立队列的内部重复；采用定量分析平台并结合统计学与机器学习方法改善组间分离、减少混杂变异并揭示潜在代谢特征。该策略发现FSHD1患者相较健康对照的广泛血浆代谢组学特征，包括57种显著改变代谢物（37种升高、20种降低），其中9种在三种分析方法中一致识别为最具判别力，15种经至少两种方法重复验证；在400余种反映不同代谢功能的代谢物和与比值中，14种经FDR校正后显著改变，多数改变此前未在FSHD中报道。这些改变提示FSHD1与涉及一氧化氮/内皮代谢、线粒体功能、氧化应激、一碳代谢、肌肉量维持和膜重塑等不同功能通路的全身性代谢改变相关。
关于肌酸酐，其下降（?25%；FDR p = 0.000003）是代谢特征中最强的判别代谢物；鉴于效应量大、与神经肌肉功能指标相关性强、分析精密度高且检测成本低，肌酸酐是信息量尤其丰富的标志物。肌酸酐是肌酸代谢副产物，被视为肌肉量的替代标志物；相应地，杜氏肌营养不良症（DMD）及其他神经肌肉疾病等肌肉萎缩相关疾病中已报道血清和尿肌酸酐降低；一项纳入555例DMD患者的近期纵向研究显示血浆和尿肌酸酐与运动功能下降显著相关；尽管DMD与FSHD机制不同，但二者均存在进行性肌肉萎缩，或可解释所观察到的肌酸酐血症降低；据研究人员所知，这是首次记录FSHD中此种关系。类似地，血浆谷氨酸和3-甲基组氨酸（3-Met-His）的轻度升高与肌肉分解代谢增加一致；未来需研究将肌酸酐水平与肌肉量测量相关联。重要的是，肌酸酐水平与肌力、FSHD评分及ACTIVLIM等临床相关神经肌肉功能参数显著相关，支持肌酸酐作为疾病严重程度无创指标的价值；虽然其未必反映疾病特异性分子机制，但可提供关于患者整体肌肉状态的临床有用信息，这在FSHD中尤为重要，因为显著不对称、异质性肌肉受累和可变进展使通过选定肌肉的肢体形态测量评估肌肉量变得复杂；仍需纵向研究确定肌酸酐水平能否作为随访评估和临床试验中的疾病进展标志物。
关于ADMA，其血浆浓度在FSHD1患者中显著升高（+17%，FDR校正p = 0.0007）；反映不对称精氨酸甲基化的ADMA/精氨酸比值在所有计算的和与比值中统计学显著性最强（+28%，FDR p = 0.0004）；据研究人员所知，这是FSHD中二甲基精氨酸失调的首次报道；此外，ADMA血浆水平与三项独立的FSHD临床严重程度指标（ACTIVLIM、肌力和FSHD评分）显著相关。ADMA由含翻译后甲基化精氨酸残基的蛋白质蛋白水解降解产生，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为一碳供体；氧化应激和炎症可通过同时减少ADMA降解和增加其生成而使ADMA水平升高；ADMA是公认的一氧化氮合酶（NOS）内源性抑制剂，一氧化氮（NO）生物合成对内皮、血管和肌肉稳态至关重要，因此ADMA升高可能减少NO生成，诱导内皮功能障碍并增加心血管风险；近期研究显示ADMA可经SLC25A45转运进入线粒体，但其线粒体内作用及对线粒体NO代谢的潜在影响尚不清楚；总之，ADMA代谢与一氧化氮生物合成、一碳代谢、线粒体功能和氧化应激等多个细胞过程相互关联。ADMA升高已在多种慢性疾病中被报道，尤其是与内皮功能障碍相关者，包括高血压、血管疾病、慢性肾病、心力衰竭和糖尿病；在肌萎缩侧索硬化等神经系统疾病中亦观察到ADMA升高并与疾病进展相关，在线粒体病MELAS中也有报道；此外，较高的循环ADMA水平可预测危重患者死亡，并与老年人年龄相关肌力丧失相关；有趣的是，DMD患者中虽有L-精氨酸/NO通路改变，但血浆ADMA浓度据报道无变化；相反，在mdx小鼠模型中已描述ADMA水平升高，其中抗肌萎缩蛋白缺乏破坏nNOSμ的肌膜定位，导致NO信号受损和功能性肌肉缺血。在本队列中，精氨酸–NO通路紊乱还得到瓜氨酸/鸟氨酸和鸟氨酸/精氨酸比值显著改变的支持，后者反映精氨酸酶活性；此外，FSHD患者肌肉氧合已被证明降低。综合来看，这些发现识别出FSHD中此前未被认识的精氨酸–NO代谢紊乱，其可能促成内皮功能障碍和骨骼肌灌注受损；FSHD中ADMA升高的机制尚不清楚，值得进一步研究；这些发现提出，旨在恢复精氨酸–NO稳态的治疗策略或值得在FSHD中评估。
关于线粒体相关通路，研究识别出多种涉及线粒体代谢相关通路的全身性代谢改变；观察到FSHD患者血乳酸水平显著升高及乳酸/己糖比值升高，乳酸升高是线粒体疾病公认的诊断标志物，反映氧化磷酸化受损时对糖酵解的依赖增加；其他代谢改变如谷氨酸升高、天冬酰胺降低及谷氨酸/谷氨酰胺和甘氨酸/丝氨酸比值降低涉及与线粒体功能密切相关的代谢通路；谷氨酸/谷氨酰胺比值反映谷氨酰胺酶活性，其在线粒体代谢缺陷时可能改变；此外，在線粒体DNA缺陷模型中已观察到丝氨酸生物合成和一碳代谢的改变。研究还分析了GDF15浓度，该细胞因子广泛用作线粒体疾病诊断的外周生物标志物；与年龄性别相似的对照者相比，患者GDF15轻度但显著升高；但需注意GDF15对线粒体疾病敏感而不特异，可在包括衰老及与癌症、心肺疾病和肌炎相关的肌少症等多种其他情况下升高；GDF15是一种一般性细胞应激反应性细胞因子，可作为整合应激反应的一部分，并由包括线粒体功能障碍、内质网应激、氧化应激、缺氧和炎症在内的多种病理生理过程诱导，而这些过程本身常相互关联。基于预设文献衍生线粒体相关代谢物组合的通路分析识别出多个与线粒体代谢相关的显著富集通路；此外，基于该预设线粒体代谢物组合的监督机器学习模型可一致区分FSHD患者与对照者。尽管线粒体功能障碍在FSHD中的作用研究甚少，既往研究已显示与线粒体功能障碍一致的形态学、功能和基因表达谱；运动试验亦曾报道FSHD患者有氧能力降低；总之，研究结果识别出涉及多种线粒体相关代谢物和通路的全身性代谢特征，这与FSHD存在线粒体功能障碍相容，但并未正式证明；仍需在骨骼肌中直接评估线粒体的进一步研究，以确定所识别代谢特征在多大程度上反映线粒体功能障碍而非其他生物学过程、线粒体功能障碍的确切机制及其病理生理相关性。
关于组氨酸，分析识别出血浆组氨酸是FSHD中下降最显著的氨基酸，证实了此前在较小FSHD队列中经核磁共振波谱获得的发现；有趣的是，同一团队报道FSHD肌肉组织中组氨酸浓度升高，提示全身组氨酸稳态改变；循环组氨酸降低也见于炎症和代谢性疾病、癌症恶病质及线粒体疾病；组氨酸通过其咪唑环直接参与细胞抗氧化防御，并作为肌肽前体间接参与；此外，组氨酸分解代谢与一碳代谢和NADPH依赖性氧化还原稳态相关；因此，循环组氨酸降低与氧化应激增加一致，而该机制此前已被认为参与FSHD病理生理学。
关于一碳代谢，研究识别出多种参与一碳代谢的代谢物显著改变，包括组氨酸、胆碱、甲硫氨酸和ADMA，以及反映该通路不同步骤的代谢物比值改变（甘氨酸/丝氨酸、同型半胱氨酸/甲硫氨酸、甜菜碱/胆碱和肌氨酸/胆碱）；据研究人员所知，这些改变此前未在FSHD中报道；一碳代谢与线粒体代谢、氧化还原稳态和甲基化反应密切关联；然而，这些改变的原因及其在FSHD中的潜在功能后果仍有待确定。
局限性方面，本研究为横断面设计，无法确定所识别代谢改变之间的因果或层级关系；所观察到的代谢改变可能代表上游致病机制、肌肉变性的下游后果、适应性反应或其组合；其次，缺乏疾病对照组使无法评估所识别代谢特征对FSHD的特异性；最后，尽管发现涉及多种线粒体相关代谢物和通路的代谢改变，但并未直接证明线粒体功能障碍，也无法确定线粒体功能障碍对所识别代谢特征的贡献程度；包括缺氧、氧化应激、炎症或肌肉变性在内的其他过程可能独立或与线粒体功能障碍共同促成这些改变；仍需纵向研究、骨骼肌线粒体直接功能评估、机制研究及其他神经肌肉疾病中的分析来阐明这些关系。
结论：本研究提供了FSHD患者全面的血浆代谢组学特征，识别出与线粒体代谢、一氧化氮生物合成、一碳代谢、膜重塑和氧化应激改变相容的协同代谢特征；这些发现识别出值得进一步机制研究并可能为未来治疗策略开发提供信息的生物学通路；血浆肌酸酐和ADMA成为有前景、廉价且易获取的疾病严重程度候选生物标志物，值得在更大且临床异质性更高的FSHD队列中验证。
