连续光发酵增值化水热碳化餐厨垃圾工艺水：工程化Rhodobacter capsulatus ΔhupAB实现高产且近纯H2

《Microbial Biotechnology》：High Hydrogen Yields During Continuous Photofermentative Valorization of Hydrothermal Carbonization Process Water by Engineered Rhodobacter capsulatus

　　

由紫色非硫细菌（purple non-sulphur bacteria, PNSB）进行的光发酵（photofermentation）制氢（H₂）是可持续能源生产的一条有前景途径，尽管底物成本和过程稳定性仍限制其大规模应用。在此，研究人员展示了利用源自餐厨垃圾水热碳化（hydrothermal carbonization, HTC）的工艺水（process water, PW）培养产H₂过量的Rhodobacter capsulatus ΔhupAB突变株，实现持续H₂生产。批次试验表明，缓冲PW支持光养生长、可溶性化学需氧量（soluble chemical oxygen demand, COD）去除和H₂生产，且无需外加定义碳源。基于这些结果，连续光发酵以3.5 d的水力停留时间（hydraulic retention time, HRT）运行，使用仅补充磷酸盐缓冲液的稀释PW，运行超过600 h，并保持持续COD去除和H₂生产。在稳定运行期（100–350 h），平均H₂产率达到178 mL H₂ g^?1 COD，与文献值相比具有优势。碳分配分析显示，PW进料下无机碳（inorganic carbon, IC）形成较低，这与还原当量向固氮酶（nitrogenase）活性重新分配相一致。该行为与较低生物量产率和增强H₂生产相关。极少的CO₂形成导致几乎纯的H₂气流。这些结果表明，连续光发酵增值化PW具有可行性，可将废物增值与高纯生物氢（high-purity biohydrogen）生产耦合。

研究背景：全球化石能源依赖及其温室气体排放突出可持续替代需求。H₂因高能量密度、无碳燃烧和燃料电池效率而成为低碳能源载体，但全球近90%的H₂仍来自化石燃料，产生“灰氢”和CO₂排放。生物制氢中的紫色非硫细菌（PNSB）光发酵可在温和条件下将有机物转化为高纯H₂，但许多系统依赖定义或纯碳源，限制大规模经济性。餐厨垃圾量大，食物损失和浪费占全球温室气体排放的8%–10%；水热碳化（HTC）适合湿生物质，除产生水热炭外还产生高化学需氧量（COD）、酸性且含营养和潜在抑制物的工艺水（PW），需处理但也可作为循环经济底物。PW的光发酵此前研究不足。Rhodobacter capsulatus代谢多样，在氮限制下可将还原当量导向固氮酶（nitrogenase）产H₂；缺失摄取氢化酶（uptake hydrogenase）的ΔhupAB突变株可防止H₂再氧化并提高净H₂产量。研究人员据此假设PW、连续培养和ΔhupAB突变株结合可促进代谢流重分配并增强产H₂，以评估底物、菌株工程和连续培养集成的连续光发酵增值化策略。

关键技术方法：研究以混合餐厨垃圾（以水果和蔬菜为主，包括番茄、生菜、苹果、橙、韭葱、卷心菜和葡萄）经180°C水热碳化1 h所得PW为底物来源；先进行批次光发酵，比较Rhodobacter capsulatus SB1003（WT）与ΔhupAB突变株在RCV+、RCV?、PW+RCV?、PW+磷酸盐缓冲液（phosphate buffer, PB）及PW条件下的生长、sCOD去除与H₂生产；随后在3 L夹套光生物反应器（photobioreactor）中进行连续光发酵，HRT为3.5 d，运行>600 h，以RCV?和PW+PB为进料；采用在线H₂传感器、气相色谱（gas chromatography, GC）、sCOD/总有机碳（total organic carbon, TOC）/IC/挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFAs）、挥发性悬浮固体（volatile suspended solids, VSS）、细菌叶绿素a（bacteriochlorophyll a, BChl a）吸收及16S rRNA基因测序分析过程性能与菌群纯度。

研究结果：3.1 工艺水的理化表征及其作为生长底物的适用性。通过理化表征发现，PW呈酸性（pH 3.9），COD达60.7 g L^?1，总固体和VSS分别为40.0和30.2 g L^?1；可溶性碳水化合物34.0 g L^?1、可溶性蛋白5.7 g L^?1，并含葡萄糖、乳酸、NH₄⁺及多种宏量和微量元素。结论是PW为高浓度、化学组成复杂的 effluent，需稀释和pH控制，但具有适合光发酵增值化的有机碳和营养储备。3.2 合成培养基与工艺水基培养基下光异养批次培养的比较分析。通过94 h批次培养比较WT和ΔhupAB在RCV+、RCV?、PW+RCV?、PW+PB和PW中的表现，发现两菌株生长模式相似，RCV中生物量和BChl a最高，PW+RCV?和PW+PB较低，PW单独无生长；RCV中pH上升，PW缓冲条件pH稳定，PW单独pH下降；PW基条件sCOD去除显著高于RCV条件，PW+PB与PW+RCV?无显著差异；ΔhupAB在RCV?产H₂约120 mL H₂ g^?1 COD，PW基条件约35–40 mL H₂ g^?1 COD，WT低于15 mL H₂ g^?1 COD；PW中残余铵造成产H₂延迟，PW单独不产H₂。结论是缓冲PW可支持光养生长、底物利用和产H₂，且仅补PB与补RCV?效果相当，ΔhupAB对产H₂提升明显。3.3 工艺水用于连续光生物制氢的增值化。通过>600 h连续光发酵并以100–350 h稳定期定量比较，发现PW+PB的生物量低于RCV?（VSS 1.87±0.88 vs. 4.98±1.15 g L^?1；OD₆₀₀ 1.00±0.34 vs. 2.00±0.35），但sCOD去除为43%±6% vs. 35%±15%，TOC去除总体相当而PW波动更大；PW中VFA初始为40–60 mg L^?1，稳态约占sCOD 10%，后期可累积至约300 mg L^?1；PW+PB平均H₂产率为178.22±188.60 mL H₂ g^?1 COD consumed，RCV?为26.14±24.20 mL H₂ g^?1 COD consumed，短暂峰值可>600 mL H₂ g^?1 COD；PW+PB累计H₂在400 h超过1000 mL H₂ L^?1、650 h接近1500 mL H₂ L^?1，RCV?在550 h后仍低于300 mL H₂ L^?1；PW+PB的IC低于RCV?（108.8±33.7 vs. 200.9±62.7 mg L^?1）；16S rRNA基因测序全部序列归于Rhodobacter属，优势序列与Rhodobacter capsulatus SB1003同一性98.9%。结论是连续PW进料可实现持续COD去除和持续产H₂，产率高于合成RCV?，并伴随较低IC形成。

讨论总结：研究人员认为连续培养使细菌在生理上适应PW，克服批次条件下复杂底物造成的限制；ΔhupAB缺失不影响生长，说明产H₂增强并非来自生物量改变；仅补PB即可，简化培养基并提高实际适用性；PW中铵浓度低于抑制钼固氮酶阈值，PW可提供固氮酶所需营养。PW下生物量较低但sCOD和TOC去除未受损，低IC、低生物量产率与高产H₂共同支持碳和还原当量更多流向固氮酶依赖型产H₂而非生物合成或完全碳氧化；VFA短暂累积被解释为底物吸收、胞内碳处理和电子汇容量之间的动态失衡，应作为胞内氧化还原平衡指标。与文献相比，纯底物优化条件可获更高产率，但该研究对真实HTC-PW的连续光发酵产率优于已报道废水系统和同底物暗发酵（20–40 mL H₂ g^?1 COD），且排气CO₂很少，形成几乎纯H₂。局限包括连续实验为单一长期运行，应视为可行性展示而非重现性定论；PW组成受原料和HTC条件影响，可能含酚类、呋喃衍生物、美拉德反应产物和难降解有机物；光生物反应器的光分布、照明能耗和连续运行均一性仍限制放大。

研究结论翻译：该研究证明利用工程化Rhodobacter capsulatus ΔhupAB菌株连续增值化餐厨垃圾来源水热碳化PW的可行性。批次实验确定磷酸盐缓冲PW为最简单且最具成本效益的培养策略，而长时间连续运行实现持续H₂生产、有效COD去除，以及与该底物光发酵和暗发酵报道值相比具有优势的H₂产率。重要的是，排出气体仅含痕量CO₂，形成几乎纯H₂气流。这些发现表明，连续培养与靶向遗传策略结合可释放复杂废物衍生底物的产H₂潜力。总之，生物量、碳分配和H₂生产数据支持碳和还原当量向固氮酶依赖型H₂生产的代谢重分配。整体而言，该工作建立了可持续光发酵废物增值化的集成策略，并为未来高纯生物氢光生物炼厂（photobiorefineries）的发展提供了坚实基础。