《Molecular & Cellular Proteomics》：High-Throughput Plasma Proteomic Profiling Identifies Novel Biomarker Candidates in Parkinson’s Disease with Cognitive Decline
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帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其诊断主要依据核心运动症状。许多PD患者会出现包括认知功能下降在内的非运动症状，后者可造成严重的功能损害。PD领域缺乏体液生物标志物，但现代蛋白质组学技术使高通量研究成为可能，并已产生有前景的结果。质谱技术为生物标志
帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其诊断主要依据核心运动症状。许多PD患者会出现包括认知功能下降在内的非运动症状，后者可造成严重的功能损害。PD领域缺乏体液生物标志物，但现代蛋白质组学技术使高通量研究成为可能，并已产生有前景的结果。质谱技术为生物标志物发现提供了无偏倚的研究途径，而血浆蛋白质组可反映包括中枢神经系统在内的全身正在进行的疾病过程。研究人员对来自瑞典Biopark队列的198例个体（130例PD患者和68例对照）的血浆样本进行了TMT标记、预分级，并采用非靶向质谱进行分析。候选生物标志物的稳健肽段通过平行反应监测（PRM）进行技术验证。分析聚焦于PD诊断与认知功能下降。研究结果与在SIMOA平台上检测的血浆神经丝轻链水平进行了比较。在发现阶段，研究人员发现了若干有前景的候选生物标志物，分别与PD诊断、认知功能下降和运动功能障碍相关。在通过PRM定量的12种蛋白质中，有6种蛋白质的肽段与发现阶段的定量结果相关。经PRM验证后发现，C9和APOC3的肽段在PD患者中与对照相比水平发生改变。此外，SAA1被发现同时与认知和运动功能障碍相关。神经丝轻链水平在伴认知损害的PD患者中升高，但其与认知功能的相关性弱于SAA1。总之，非靶向质谱是生成PD血浆新型候选生物标志物的可行方法，其中若干标志物（包括SAA1、C9和APOC3）已通过PRM获得技术验证。
研究背景与问题：帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，临床诊断主要依赖运动症状，而几乎所有患者均会伴随自主神经功能障碍、睡眠障碍和认知功能下降等非运动症状，其中认知功能下降是导致生活质量下降的主要原因之一。PD患者发生痴呆的风险为一般人群的2.5–6倍，患病率约为25–30%。目前PD领域缺乏准确、特异且可重复的生物标志物，而早期准确诊断对于实施疾病修饰药物至关重要，预后标志物则有助于区分疾病表型并作为药物试验终点。脑脊液（CSF）中的种子聚集试验（SAA）和神经丝轻链（NfL）虽显示出一定价值，但血液采样创伤更小、可扩展性更强，且PD存在大量周围病理证据，包括皮肤、肠神经系统、迷走神经和嗅球中的α-突触核蛋白（α-syn）沉积，以及线粒体、溶酶体和炎症等全身性改变。既往血浆蛋白质组研究多采用靶向多重方法或仅能定量高丰度蛋白，重复性有限，因此有必要开展无偏倚的高通量质谱发现研究。
研究开展与结论：研究人员利用大规模非靶向质谱，在瑞典Biopark队列中开展发现研究，以识别PD诊断及PD相关认知功能下降的新候选生物标志物，并对最稳健的候选肽段采用平行反应监测（PRM）进行技术验证。研究结论为：非靶向质谱是生成PD血浆新型候选生物标志物的可行方法，其中SAA1、C9和APOC3等若干标志物已通过PRM获得技术验证，其表现与NfL相当，但这些候选蛋白仍需在外部队列中进一步验证。
关键技术方法：研究纳入瑞典斯德哥尔摩Biopark队列的198例个体（130例PD、68例对照），血浆经免疫亲和去除白蛋白和IgG、还原烷基化、胰蛋白酶消化后行TMT10plex标记、高pH反相肽段分级，采用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行非靶向数据依赖采集（SPS-MS3）；候选肽段以PRM在Orbitrap Lumos上验证；NfL采用SIMOA HD-1平台检测；数据分析使用R语言limma、caret、e1071等包完成差异分析、机器学习建模与生存分析。
研究结果：
demographics：共纳入198例受试者，组间性别匹配但年龄未匹配（p=0.046），PD患者涵盖不同认知功能水平与认知下降速率，主成分分析显示运动症状、病程、年龄与左旋多巴等效日剂量（LEDD）高度共线，心理测量与非运动症状评分共线。
PD与对照的蛋白质组分析：2263种蛋白质纳入差异分析，PCA与t-SNE未见明显组间聚类；以年龄和性别为协变量，最显著升高蛋白为平滑肌肌球蛋白轻链激酶（MYLK），最显著降低蛋白为Xaa-Pro二肽酶（PEPD），EPC2判别潜力最高（AUC=0.778）；KEGG通路分析显示"补体与凝血级联"通路显著富集。肽段分析中MYLK肽段在PD中持续升高。
SVM与生物标志物性能：逻辑回归模型中NYAP2单个蛋白AUC最高达84%；多支持向量机递归特征消除（mSVM-RFE）显示10蛋白组合AUC稳定达90%，23蛋白时接近100%。
运动严重程度：与H&Y和UPDRS III正相关最强的蛋白为SAA1、SAA2和PRR9，负相关者为RFX7和ARMCX5，且均与病程和LEDD无关；诊断标志物与严重程度标志物重叠稀少，仅PHLDB2兼具两者。
认知功能：与MoCA相关性最强的蛋白为SAA1、IQCC、MAP10和GAS2L3；纵向分析显示与PD轻度认知损害（PDMCI）转化关联最强的蛋白为LPA、DNAH1、KRT1、TET1，与PD痴呆（PDD）转化关联最强的为LUM、PROC、APOA4和OSBPL3。
PRM验证：72个候选蛋白中12个具备高质量肽段，6个蛋白肽段与发现阶段中度相关；C9肽段TEHYEEQIEAFK（p=0.0088）和APOC3肽段DALSSVQESQVAQQAR（p=0.028）在PD中显著改变；SAA1肽段FFGHGAEDSLADQAANEWGR与MoCA（p=0.0091）和H&Y（p=0.0035）均相关。
NfL：NfL在PD中升高（p=0.014），仅在伴认知损害的PD亚组中升高（p=0.022），与H&Y相关（Spearman=0.23，p=0.009）而与MoCA无关，且高度受年龄影响（Spearman=0.61）；SAA1肽段与MoCA的相关性优于NfL，联合NfL后对MoCA和H&Y模型的调整R2分别由0.15升至0.17、由0.22升至0.25。
讨论与结论：本研究是迄今采用质谱开展的最大规模PD非靶向血浆蛋白质组研究，发现血浆蛋白质组在PD与对照间存在差异，多个候选标志物经PRM成功验证，部分表现与NfL相当但联合NfL后增益有限。APOC3虽未在PD中广泛研究，但其他载脂蛋白（如APOA1、APOD、APOE、APOJ）已被认为与PD相关；C9升高与补体系统作为候选血浆标志物的既往证据一致；SAA1是唯一经PRM验证且在校正协变量后同时与认知损害和运动严重程度显著相关的候选标志物，既往研究显示PD脑脊液中血清淀粉样蛋白升高可预测认知下降，PD黑质蛋白质组中SAA1亦为升高最显著的蛋白。多数发现阶段顶级候选标志物因技术差异未能通过PRM验证，但几乎所有PRM分析蛋白在更严格的1% FDR分析中亦可定量，提示其仍具未来验证价值。研究局限性包括未加入稳定同位素标记肽段、缺乏独立验证队列、队列异质性使纵向分析解释受限。研究结论为：这项大规模无偏倚蛋白质组发现研究产生了若干PD诊断与认知相关候选生物标志物，其中多个经PRM技术验证且表现与NfL相当，理想情况下这些候选蛋白需在未来的外部队列中加以验证。
