单细胞RNA测序揭示人骨关节炎软骨细胞亚群对转化生长因子β1的差异性反应

《Osteoarthritis and Cartilage Open》：Single-cell RNA sequencing elucidates the divergent response of human osteoarthritic chondrocyte subsets to Transforming Growth Factor Beta 1

转化生长因子β1（TGF-β1）对健康软骨的稳态至关重要，但在骨关节炎（OA）软骨中，它诱导包括软骨细胞肥大在内的有害过程。大多数关于TGF-β对软骨组织和细胞影响的体外研究局限于二维（2D）或非人类培养体系，并采用常规的整体水平分析。由于许多关键过程，如软骨细胞肥大或纤维化分化，可归因于单一软骨细胞亚群，因此在研究对TGF-β的反应时应考虑细胞异质性。因此，本研究对TGF-β刺激后的人骨关节炎软骨外植体进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），以阐明软骨细胞亚型对TGF-β的特异性反应。研究人员将人骨关节炎软骨外植体用10 ng/ml TGF-β1刺激6天。通过基因表达、糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）含量和释放以及一氧化氮（nitric oxide, NO）释放评估整体水平变化。单细胞RNA分析用于评估TGF-β1的亚型特异性效应。整体分析显示肥厚相关标志物（COL10A1、RANKL、ADAMTS5和VEGFA）增加，软骨形成标志物（COL2A1和ACAN）减少。通过单细胞RNA测序鉴定出不同的软骨细胞群体，包括（前）肥厚型、（pre-hypertrophic）、浅表型和纤维化型软骨细胞，每种细胞对TGF-β表现出独特的反应。重要的是，TGF-β1诱导的表观肥厚反应主要由（前）肥厚型簇中肥厚相关基因表达增加驱动，而TGF-β1在浅表型和纤维化软骨细胞中促进软骨形成分化并发挥抗分解代谢作用。本文强调了在骨关节炎软骨中不同反应如何共存，并解释了以往研究中矛盾的发现。重要的是，它强调治疗性调控可能需要细胞状态特异性、空间性或上下文依赖性方法。

**研究背景与目的**

转化生长因子β（TGF-β）是一种多效性因子，在软骨稳态中具有双重作用。在健康软骨中，TGF-β对组织发育和基质稳态至关重要；但在骨关节炎（osteoarthritis, OA）中，TGF-β反而诱导软骨细胞肥大和分解代谢酶表达，加剧软骨退变。既往关于TGF-β对软骨影响的研究大多基于二维培养或非人类模型，并采用整体水平分析，难以揭示细胞亚群的异质性反应。由于软骨细胞肥大、纤维化分化等关键过程可能仅发生特定亚群中，整体分析可能掩盖亚型特异的效应。因此，研究人员利用单细胞RNA测序技术，在人OA软骨外植体中研究TGF-β1刺激后软骨细胞亚型特异的转录反应，旨在阐明TGF-β在软骨中的矛盾作用并优化治疗策略。

**研究概述与主要结论**

研究人员从12例接受全膝关节置换术的OA患者（8女4男，平均年龄68.75±7.07岁）获取软骨，建立外植体培养模型，以10 ng/ml TGF-β1刺激6天，并进行了整体基因表达分析、糖胺聚糖含量和释放检测、一氧化氮释放检测，以及单细胞RNA测序。整体分析显示，TGF-β1上调肥厚相关标志物（COL10A1、RANKL、ADAMTS5和VEGFA），下调软骨形成标志物（COL2A1和ACAN）。单细胞测序则揭示了七种转录上不同的软骨细胞群体，各亚群对TGF-β1的反应截然不同：TGF-β1驱动（前）肥厚型软骨细胞向终末肥大状态分化，而在PRG4⁺浅表软骨细胞中则促进软骨形成并抑制纤维化。该研究首次在人体OA软骨中证明，TGF-β1的净效应是多种亚群反应相互抵消的结果，这解释了以往文献中看似矛盾的发现，并强调靶向TGF-β通路需考虑细胞状态和空间位置。

**主要技术方法**

该研究采用人OA软骨外植体培养模型（来源为荷兰两家医院共12例患者），应用整体基因表达分析（定量PCR）、生化检测（二甲基亚甲蓝法测GAG、Griess法测NO）和单细胞RNA测序（10x Genomics平台）。单细胞数据分析包括聚类分析、差异表达分析、伪时间分析、RNA velocity分析、基因集富集分析等，并通过供者去卷积和配对设计控制批次和个体差异。

**研究结果**

*TGF-β1在人类OA软骨外植体模型中刺激软骨细胞肥大*

通过整体水平分析，研究人员发现TGF-β1刺激6天后，肥厚相关基因（COL10A1、RANKL、ADAMTS5、VEGFA、TGM2）表达增加，而软骨形成标志物ACAN和COL2A1表达降低；同时培养基中NO释放增加，但GAG含量和释放未发生可测量变化。这表明TGF-β1在该模型中引发了分解代谢反应。

*OA软骨包含供者间相似的异质性细胞群体*

单细胞RNA测序鉴定出七个软骨细胞簇，包括合成代谢型、前肥厚型、肥厚型、分解代谢型、PRG4⁺纤维化型、PRG4⁺分解代谢型及PRG4⁺合成代谢型。其中MMP13在肥厚簇中并未富集，而主要表达于PRG4⁺和分解代谢型簇，提示常用肥大标志物在单细胞水平可能具有不同分布。

*TGF-β1诱导OA软骨表型改变及亚簇特异性反应*

与对照组相比，TGF-β1处理后前肥厚软骨细胞比例轻度增加，PRG4⁺分解代谢细胞增加，而分解代谢簇和PRG4⁺纤维化簇明显减少。伪时间分析显示肥厚簇中TGF-β1处理细胞富集于晚期，RNA velocity显示流向高表达COL10A1的终末区域，提示亚簇层面存在更精细的反应。

*TGF-β1刺激肥厚软骨细胞的终末分化*

对肥厚软骨细胞亚簇再分析发现四个亚簇，其中高表达COL10A1和IBSP的亚簇在TGF-β1处理后比例增加（FC=1.314），且所有亚簇中COL10A1表达均升高；但未检测到凋亡相关基因上调。前肥厚细胞分析显示，高表达线粒体基因的亚簇比例增加（FC=1.42），而高表达抗肥厚因子FRZB的亚簇比例下降。结果表明TGF-β1促进已具有（前）肥厚表型的软骨细胞进一步肥大分化。

*PRG4阳性软骨细胞在TGF-β1刺激下由纤维化表型转向合成代谢表型*

对PRG4⁺细胞亚群分析显示，TGF-β1处理后出现新的合成代谢型亚簇（FC=16.6），其高表达COL2A1、COL9A2等软骨基质基因，而纤维化亚簇和分解代谢亚簇显著减少。RNA velocity分析表明，对照组流向纤维化亚簇，而TGF-β1处理后流向合成代谢亚簇，提示TGF-β1促进浅表区软骨细胞向保护性表型转化。

**讨论与结论**

该研究首次在人类OA软骨外植体中解析了TGF-β的亚型特异性效应。整体分析显示的肥大反应主要源自已有（前）肥厚表型细胞的终末分化基因表达增强，而浅表PRG4⁺细胞则获得合成代谢表型。这解释了TGF-β研究中“保护”与“破坏”并存的矛盾，也提示整体水平分析可能抵消亚群特异的有利效应。研究存在一定局限性，如样本量小、性别比例不均衡、单时间点设计、缺乏空间验证等，但结论仍强调TGF-β1本身并非绝对合成或分解代谢因子，其作用高度依赖软骨细胞身份与分化状态。因此，临床上应谨慎使用全局性靶向TGF-β通路的治疗策略，而应发展细胞状态特异性、空间靶向或情境依赖的调控方式。该研究同时展示了单细胞转录组学在揭示软骨细胞异质性反应中的关键价值，对未来OA药物开发具有重要指导意义。