《Parasite Epidemiology and Control》：Diagnostic accuracy of polymerase chain reaction using conjunctival swabs for canine visceral leishmaniasis: A systematic review and meta-analysis
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犬内脏利什曼病是一种具有重大公共卫生意义的重要人兽共患病。其实验室诊断仍然具有挑战性，尤其是在流行地区。采用结膜拭子样本的聚合酶链反应（PCR）作为一种微创方法，已引起人们对婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）分子检测的关注。本研究旨在综合
犬内脏利什曼病是一种具有重大公共卫生意义的重要人兽共患病。其实验室诊断仍然具有挑战性，尤其是在流行地区。采用结膜拭子样本的聚合酶链反应（PCR）作为一种微创方法，已引起人们对婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）分子检测的关注。本研究旨在综合现有证据，评估采用结膜拭子样本的PCR诊断犬内脏利什曼病的灵敏度和特异度。该系统评价按照系统评价和Meta分析首选报告条目（PRISMA）建议开展。检索在PubMed、Web of Science、SciELO和LILACS中进行。经过筛选过程，共有17项研究被纳入定性综合和定量综合。方法学质量采用诊断准确性研究质量评价工具第2版（QUADAS-2）进行评估。采用双变量随机效应Meta分析获得灵敏度和特异度的合并估计值，同时通过辅助的单变量随机效应模型估计诊断比值比（DOR）。潜在的小样本效应采用Deeks漏斗图不对称检验进行评估，双侧p值<0.10被认为提示漏斗图不对称具有统计学意义。Meta分析得出合并灵敏度为77.8%（95% CI：67.9至85.3%），合并特异度为95.5%（95% CI：91.1至97.8%）。虽然联合灵敏度和特异度估计值显示不一致性较低（I2 = 16.7%），但在DOR中观察到显著异质性（I2 = 75.2%）。Deeks漏斗图不对称检验未显示具有统计学意义的不对称（p = 0.1765）。采用基于动质体DNA（kDNA）方案和双侧结膜采样的研究倾向于表现出更高的诊断性能。总体而言，采用结膜拭子的PCR在优化的实验室条件下显示出有前景的诊断性能；然而，在该方法被推荐作为现有诊断策略的独立替代方案之前，仍需进一步开展标准化的诊断准确性研究。
研究背景方面，犬内脏利什曼病由利什曼原虫属原虫引起，呈全球分布，在巴西等流行区尤为重要。该病诊断困难，原因在于致病利什曼原虫种类多样，且需要灵敏度足够高的技术以识别症状性和无症状犬。部分流行区无症状犬可占感染动物的85%，这些犬作为持续储存宿主维持传播循环，因此早期发现包括无症状犬在内的感染犬具有重要意义。分子检测的灵敏度在很大程度上取决于所评价的组织类型，骨髓、淋巴结和脾脏最适合检测利什曼原虫DNA，但这些组织的采集具有侵入性、引起疼痛，常需镇静或专门临床条件，导致犬主在大规模筛查中依从性差。此外，PCR灵敏度取决于靶标，动质体DNA微环（kDNA）与高灵敏度关联最密切。结膜拭子或血液等侵入性较低的样本是替代选择。结膜拭子因采集方便、动物不适感低、可用于流行病学研究和大规模犬只筛查而受到关注。PCR可检测临床疑似犬和无症状犬的利什曼原虫感染。与外周血常表现不一致的寄生虫血症及存在PCR抑制物不同，结膜拭子采样可检测可能在感染早期、有时甚至在血清转阳之前携带寄生虫的脱落上皮细胞。然而，现有研究报告的PCR灵敏度和特异度差异很大，可能与所用PCR类型、研究人群、动物临床阶段、疾病传播的季节性变异及采样时间等方法学差异有关。尽管评价结膜拭子PCR的研究不断增多，但其与传统参考试验相比的诊断准确性仍未达成共识，缺乏标准化阻碍了明确临床方案的建立，尤其涉及常规PCR、巢式PCR或实时PCR的选择以及低生物量样本最有效的DNA提取方法。此外，无症状犬结膜拭子阳性结果的预后价值——是预测最终发生活动性疾病还是仅反映短暂暴露——仍存争议。现有证据缺乏系统综合，限制了对单项结果的解释以及临床实践和流行病学监测项目中结膜拭子PCR使用决策的制定。因此，本研究旨在综合和分析现有证据，评估结膜拭子样本PCR诊断犬内脏利什曼病与其他文献所述诊断方法相比的灵敏度和特异度。
研究人员开展了系统评价与Meta分析，遵循PRISMA方法学指南，研究问题按PICO策略构建：人群为疑似或确诊内脏利什曼病的犬，干预为结膜拭子样本PCR，比较为其他诊断方法，结局为诊断灵敏度和特异度。研究最终纳入17项原始研究，得出合并灵敏度77.8%、合并特异度95.5%，合并DOR为76.45，SROC曲线下面积（AUC）为0.949。研究结论认为，结膜拭子PCR在优化实验室条件下显示出有前景的诊断性能，但在被推荐作为现有诊断策略的独立替代方案之前，仍需进一步开展标准化的诊断准确性研究。其重要意义在于首次对结膜拭子PCR诊断犬内脏利什曼病的证据进行系统综合，为临床实践和流行病学监测提供了量化依据，同时明确了现有研究的方法学局限和标准化需求。
关键技术方法方面，研究人员检索PubMed、Web of Science、SciELO和LILACS四个数据库（检索日期2025年10月13日，无年份和语言限制），经去重、题录摘要筛选和全文评估后纳入17项研究；采用QUADAS-2工具由两名评价者独立评估偏倚风险和适用性关注；由两名评价者独立提取数据，每项研究贡献一个研究水平的2×2列联表，同一研究存在多种PCR方案时按预设标准仅保留一个索引试验结果；采用基于Reitsma模型的双变量随机效应Meta分析（R软件mada包0.5.12版）合并灵敏度和特异度并生成SROC曲线，采用单变量随机效应模型估计合并DOR，采用Deeks漏斗图不对称检验评估小样本效应，并按人群临床谱和参考标准进行亚组分析。样本来源为已发表文献，未涉及原始队列采集。
研究结果方面，3.1 纳入研究的质量评价：QUADAS-2评估显示，患者选择领域13项研究为高偏倚风险、1项不确定、3项低风险；索引试验领域1项高风险、15项不确定、1项低风险；参考标准领域2项高风险、12项不确定、3项低风险；流程与时间领域2项高风险、1项不确定、14项低风险。适用性关注方面，患者选择领域5项高关注、12项低关注，索引试验和参考标准领域全部17项均为低关注。3.2 纳入研究的特征：研究以横断面设计为主，仅2项含纵向成分；主要开展于犬内脏利什曼病流行国家，巴西11项、意大利3项、以色列1项、德国2项；样本量33至253只犬，全部研究均纳入感染阳性和阴性动物。3.3 分子与比较方法：DNA提取方法包括手工方案、商业试剂盒及直接裂解或上清液等简化技术；PCR技术包括实时PCR（qPCR）、常规PCR（cPCR）和巢式PCR（nPCR）；分子靶标包括kDNA、ITS-1和SSU-rDNA；参考试验包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFAT）等血清学方法，细胞学、培养和免疫组化等寄生虫学方法，以及骨髓、淋巴结、脾和血液等侵入性组织的PCR。3.4 结膜拭子PCR与对照样本的灵敏度和特异度：结膜拭子样本PCR灵敏度范围为9.2%至100%，多数研究高于70%；特异度范围为63%至100%。3.5 定量综合：双变量随机效应Reitsma模型得出合并灵敏度0.778（95% CI 0.679至0.853）、合并特异度0.955（95% CI 0.911至0.978），Zhou和Dendukuri法估计研究间异质性为16.7%；单项研究灵敏度估计值范围为0.375至0.983，特异度范围为0.630至1.000，多数研究报告特异度为1.000；SROC曲线AUC为0.949，归一化部分曲线下面积（pAUC）为0.895；合并DOR为76.45（95% CI 28.18至207.37），存在显著异质性（τ2 = 2.73，I2 = 75.2%，95% CI 60.3%至84.6%；Cochran's Q = 64.63，df = 16，p < 0.0001）；Deeks检验未提示显著漏斗图不对称（t = ?1.42，df = 15，p = 0.1765）。亚组分析显示，广临床谱研究（n = 12）合并灵敏度0.769（95% CI 0.652至0.856）、特异度0.948（95% CI 0.920至0.966）、AUC 0.953；窄临床谱研究（n = 5）合并灵敏度0.808（95% CI 0.578至0.928）、特异度0.939（95% CI 0.774至0.986）、AUC 0.940，两亚组I2均为0%。按参考标准分层，单纯血清学亚组（n = 4）合并灵敏度0.722（95% CI 0.532至0.856）、特异度0.943（95% CI 0.906至0.966）、AUC 0.949；血清学加寄生虫学确认亚组（n = 5）合并灵敏度0.858（95% CI 0.707至0.938）、特异度0.950（95% CI 0.843至0.986）、AUC 0.953；复合参考标准亚组（n = 8）合并灵敏度0.742（95% CI 0.566至0.864）、特异度0.971（95% CI 0.881至0.993）、AUC 0.930，I2分别为0%、0%和35.9%。
讨论部分总结如下：研究以巴西为主反映了该国犬内脏利什曼病的地方流行性，意大利和以色列等地中海疫源地研究亦显示当地存在地方性流行灶，德国非流行区研究提示结膜拭子qPCR有助于排除有风险区暴露史的犬感染。QUADAS-2评估显示5项研究在患者选择领域同时存在高偏倚风险和高适用性关注，这些研究采用两门设计，将健康对照与仅限症状性或仅限无症状动物的感染组比较，导致谱偏倚，其准确性估计可能无法推广至临床实践；另有8项研究因缺乏连续或随机入组、采用便利抽样而被判为高偏倚风险，其中3项研究因犬只已有血清学或寄生虫学阳性结果而被有意招募，1项研究采用依赖犬主自愿参与的非概率样本，提示报告的诊断准确性可能被高估。结膜拭子PCR的报告灵敏度可能主要受人群谱偏倚影响，3项预先选择高寄生虫负荷症状性犬的研究获得73.9%至95.6%的高灵敏度，1项仅纳入寄生虫学确认动物的研究获得90%至100%的高灵敏度。唯一在索引试验领域被判为高偏倚风险的研究为Solcà等（2014），因其qPCR阳性阈值未预先设定，而是用自身数据经ROC曲线优化确定，存在高估准确性的显著风险。单侧与双侧结膜拭子采集比较显示后者提高寄生虫检出，Solcà等（2014）报告左、右结膜拭子qPCR灵敏度分别为37.5%和29.2%，Strauss-Ayali等（2004）报告cPCR灵敏度由单侧83%升至双侧92%，提示结膜黏膜寄生虫分布在同一动物双眼间可能不均匀。结膜拭子高PCR灵敏度与kDNA的高多拷贝特性密切相关，Marcelino等（2020）揭示kDNA靶标在结膜拭子cPCR中的诊断灵敏度优于ITS-1等核糖体标志物或hsp70等单拷贝基因。使用核糖体靶标时nPCR检测利什曼原虫DNA有效，Di Muccio等（2012）以SSU-rDNA为靶标的nPCR在结膜拭子上获得76.38%灵敏度，与Leite等（2010）和Carvalho Ferreira等（2014）以ITS-1为靶标的nPCR报告的83.3%至90%灵敏度一致。参考标准方面，Ferreira等（2008）和Pilatti等（2009）因仅依靠ELISA、IFAT和补体结合反应（CFR）等血清学方法定义感染状态而被判高偏倚风险，仅使用公认有局限的方法而无寄生虫学或分子确认不足以正确分类目标疾病，可能导致动物错分并扭曲结膜拭子PCR的灵敏度和特异度。流程与时间方面，Strauss-Ayali等（2004）因并非所有犬接受寄生虫学参考标准且各组应用不同参考试验而存在验证偏倚，Geisweid等（2013）因5只犬未能进行骨髓PCR金标准检测而被排除于主要诊断准确性分析，均被判高偏倚风险。参考标准方法比较表明，主要差异出现在结膜拭子PCR与血沉棕黄层PCR及血清学的比较中，Ferreira等（2008）证明结膜样本cPCR的寄生虫检出频率可超过血沉棕黄层的四倍以上，Di Muccio等（2012）发现结膜拭子nPCR阳性结果频率为血沉棕黄层的两倍以上，Pereira等（2016）显示结膜拭子cPCR阳性与临床症状存在关联而血液cPCR阳性与无临床症状相关，提示血液可能是较不可靠的诊断基质。另一方面，结膜拭子PCR性能总体低于侵入性方法，Selder等（2018）和Caldas等（2020）证实寄生虫检出频率以结膜拭子最低、骨髓和淋巴结抽吸物较高，Solcà等（2014）观察到结膜拭子PCR寄生虫检出频率不足脾样本的一半，提示结膜拭子PCR灵敏度取决于寄生虫在体内各组织的播散和分布。尽管具有实用优势，结膜拭子用于犬内脏利什曼病分子诊断仍存在明显局限：Gramiccia等（2010）发现结膜拭子对利什曼原虫早期检测无效，阳性转化速度慢于血沉棕黄层；采样变异性是另一关键挑战，采集的生物物质量在不同患者间或同一个体不同样本间可差异极大；诊断准确性还取决于具体PCR方案和所选分子靶标，这些变量妨碍了该技术的通用标准化。合并灵敏度77.8%及其较大变异反映了方法学异质性的显著影响，灵敏度峰值归因于kDNA的多拷贝特性，Carvalho Ferreira等（2014）以kDNA为靶标的qPCR在感染犬中灵敏度为96.7%（无症状）至100%（有症状），4项以kDNA为靶标的cPCR研究报告86%至97%的灵敏度；而采用包含侵入性组织PCR的复合参考标准是合并灵敏度下降的决定因素，5项此类研究的灵敏度最高为78.4%。合并特异度95.5%反映了多数研究一致报告的高值，13项研究报告100%特异度，即使提取方法、分子技术、遗传靶标和人群不同，表明结膜拭子PCR特异度假阳性风险低。相反，3项研究报告略低于合并估计值的特异度（92.7%至94%），Solcà等（2014）采用潜类别分析（LCA）模型估计的特异度显著较低（63%）。
研究结论（译文）：总体而言，采用结膜拭子的PCR在优化的实验室条件下显示出有前景的诊断性能；然而，在该方法被推荐作为现有诊断策略的独立替代方案之前，仍需进一步开展标准化的诊断准确性研究。
