夏威夷果果壳转录组与靶向激素代谢组分析揭示植物激素对幼果脱落的影响

《Scientia Horticulturae》：Transcriptomic and targeted hormone metabolomic profiling of macadamia husk reveals the effects of phytohormones on fruitlet abscission

夏威夷果（Macadamia integrifolia）作为一种具有高营养和经济价值的坚果作物，在热带和亚热带地区商业化种植以生产优质食用果仁。粗花序轴类型（IT）的幼果保留率是细花序轴类型（IS）的两倍。果壳激素调控IT与IS之间截然不同的幼果脱落行为。IS果壳中IAA、tZ和JA含量较高，而ABA、GA3和乙烯含量较低。一个由53个激素相关差异表达基因（DEGs）组成的网络驱动了IT与IS之间果实脱落的差异。为验证这一假设，研究人员对IT和IS果实三个早期发育阶段的果壳组织进行了联合转录组和靶向激素代谢组分析，将全基因组基因表达变化与特定激素的积累直接关联。结果表明，IT与IS之间截然不同的果实脱落行为伴随着果壳中IAA、GA、CTK、ABA、JA和乙烯生物合成及信号转导的时间性差异。果壳中GA3、ABA和乙烯的降低以及IAA、tZ和JA/JA-ILE的升高可能与IT的果实保留相关。此外，RNA-seq揭示了HT与HS之间大量参与这六类激素生物合成、代谢和信号转导的基因的差异表达。果壳中基于激素的变化可能通过多种激素间的动态互作促成IT的早期果实脱落。本研究鉴定出激素相关DEGs与差异激素代谢物的协同变化，为理解夏威夷果幼果脱落的分子基础提供了见解，尽管这些候选DEGs的功能作用仍有待未来研究验证。

论文解读

一、研究背景与意义

果实脱落是影响作物产量的重要生理过程。夏威夷果（Macadamia integrifolia）作为高营养价值的经济坚果作物，一棵成年树可产生超过10,000个总状花序，每个花序含100至300朵花。然而，开花后两周内仅有不到10%的花成功坐果，随后8周内超过80%的幼果发生脱落，严重制约了夏威夷果的产量和产业发展。

果实脱落是在离区（AZ）这一特化组织中发生的精确程序化发育过程，通常经历四个连续步骤：离区细胞分化、离区激活、细胞分离和脱落完成。大量研究表明，植物激素在果实坐果和发育中发挥核心调控作用。生长素（IAA）、赤霉素（GA）和细胞分裂素（CTK）通过调控细胞分裂和扩张促进果实起始与生长，而脱落酸（ABA）和乙烯则参与果实脱落的激活和执行。尤其重要的是，生长素与乙烯之间的相互作用对决定幼果命运（脱落或继续发育）至关重要。生长素耗竭使离区细胞获得响应乙烯的能力，这一概念已在棉花、番茄、拟南芥和葡萄等物种中得到验证。

在夏威夷果中，不同花序类型表现出截然不同的果实保留能力。粗花序轴类型（IT）表现出更强的坐果能力，而细花序轴类型（IS）果实负载较弱。前期研究已发现IT幼果积累较高水平的促生长激素（如IAA、tZ和GA₁）和较低水平的胁迫相关激素（如JA、Me-JA和ABA），但赋予IT果实更高保留率的分子机制尚不清楚。果壳作为幼果最外层且代谢最活跃的组织，是感知和响应胁迫的首要部位，在碳水化合物饥饿胁迫下可产生脱落相关激素信号。然而，此前研究仅依赖有限激素、碳水化合物和候选基因的靶向测定，缺乏全基因组范围的转录组或代谢组视角来揭示脱落背后的激素和代谢变化。因此，研究人员提出假设：IT与IS果壳之间不同的果实保留行为由参与激素生物合成、代谢和信号转导的基因表达协同变化驱动，且这些转录变化与相应激素代谢物的变化相呼应。

二、研究内容与主要结论

为验证上述假设，研究人员在贵州省赤水市（105°12′E，28°52′N；海拔600 m）的成熟夏威夷果园中，于2023年4月至5月开展了田间试验。选用6株8年生夏威夷品种'H2'树，采用随机区组设计，3次重复。在花后28天（DAA），从每棵树不同冠层位置选取16个带果枝梢，标记IT和IS类型的花序。在28、42和56 DAA三个时间点采集果壳样本，分别命名为HT1、HT2、HT3（IT果壳）和HS1、HS2、HS3（IS果壳），进行转录组测序和靶向激素代谢组分析。

研究结果显示，从28 DAA到56 DAA，IT和IS每花序平均果数分别大幅下降43.6%和73.8%。至56 DAA时，IT每花序果数是IS的5.5倍。IT的累计落果率在56 DAA时增至44.1%，显著低于IS的82.3%。这证实了夏威夷果在早期果实发育阶段经历严重幼果脱落，且不同花序类型间脱落程度差异显著。

三、关键技术与方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：（1）靶向激素代谢组学分析：采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）系统，通过多反应监测（MRM）模式对果壳样本中24种激素相关代谢物进行定量检测；（2）转录组测序（RNA-seq）：利用Illumina Novaseq6000平台对18个cDNA文库进行双端测序，获得高质量clean reads后比对至夏威夷果参考基因组（MacadamiaGGD.net），通过DESeq2包鉴定差异表达基因（DEGs）；（3）GO和KEGG功能富集分析：对DEGs进行基因本体和通路富集以揭示生物学功能；（4）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证：选取12个激素相关DEGs进行表达验证，确认RNA-seq数据的可靠性。

四、研究结果

4.1 果实坐果变化

通过定期观测标记花序的果实数量，研究人员发现从28 DAA至56 DAA，IT和IS的每花序平均果数均急剧下降，但IT的下降幅度（43.6%）远小于IS（73.8%）。至56 DAA，IT的累计落果率为44.1%，显著低于IS的82.3%，表明IT具有更强的果实保留能力。

4.2 激素相关代谢物含量

通过靶向激素代谢组分析，研究人员在果壳中检测到24种激素相关代谢物在HS与HT之间存在显著差异。与HS相比，HT在S3阶段TRP、2MeScZR和ABA含量显著降低，在S1阶段GA₃、IP和IPRMP含量也显著降低。HT的JA-ACC含量在S1和S3均显著低于HS，OPDA和JA-ILE在S2、JA在S1和S2也显著较低。然而，HT在S3阶段的IAN、IAA、GA₁₉、OPDA、JA、JA-ILE、JA-Val和Me-JA含量显著高于HS，DHZROG在S2、GA₈、tZOG、tZ9G和tZR在S1也显著较高。此外，Me-IAA在S1和S2、IPR在S1和S3、tZRMP在S2和S3均显著高于HS，tZ在所有阶段均显著较高。

4.3 转录组测序及比对

对HT和HS三个发育阶段的果壳样本进行转录组测序，共构建18个cDNA文库。每个文库获得约36.3至52.5 Mb的clean reads，Q30比例高于91.37%，GC含量高于44.86%。平均每个文库有38.3 Mb clean reads（占总数的91.52%）成功比对至夏威夷果参考基因组。共检测到28,104个基因，包括25,759个参考基因和2,345个新基因。主成分分析显示各样本组内三个生物学重复清晰聚类，不同样本组间明显分离。

4.4 差异表达基因功能分析

通过HS1 vs HT1、HS2 vs HT2和HS3 vs HT3三个比较组，共鉴定出982个DEGs。三个比较组的DEGs数量分别为212、187和653个，其中HT1、HT2和HT3分别有84、83和374个上调DEGs以及128、104和279个下调DEGs。韦恩分析显示三个比较组间仅有2个共有DEGs，表明果壳发育阶段存在明显的阶段特异性转录组重编程。KEGG富集分析显示，192个DEGs富集到84个通路中，其中'植物激素信号转导'、'半胱氨酸和蛋氨酸代谢'、'玉米素生物合成'和'类胡萝卜素生物合成'等通路显著富集，另有5个DEGs富集在参与JA产生的'α-亚麻酸代谢'通路。

4.5 激素代谢和信号转导相关DEGs

基于KEGG通路富集和基因功能注释，研究人员筛选出53个激素相关DEGs，包括13个生长素相关、6个CTK相关、5个GA相关、7个ABA相关、10个JA相关和12个乙烯相关DEGs。

在生长素相关DEGs中，AUX22、IAA16、GH3.1、GH3.17、SAUR36和SAUR50等8个基因参与生长素信号转导，多数在HS2 vs HT2或HS3 vs HT3中上调表达。PIN1C、PIN3和PILS3等3个基因与生长素运输相关，其中PIN3和PILS3在HT3中下调，而PIN1C则上调。ILL1和YUC10参与生长素代谢。

6个CTK相关DEGs均参与CTK代谢。CKX1在HT3中上调，LOGL1在HT1中上调，CKX3（ncbi_122079156）在HS1 vs HT1和HS3 vs HT3中上调，UGT73C3和CKX3（ncbi_122068735）分别下调，CYP714C2在HS1 vs HT1中下调而在HS3 vs HT3中上调。

5个GA相关DEGs中，仅GA2OX1参与GA代谢且在HS3 vs HT3中下调，其余4个（CIGR1和3个GASA1）参与GA信号响应，在HS2 vs HT2和/或HS3 vs HT3中上调。

7个ABA相关DEGs中，CYP707A2、LCY1和NCED1参与ABA生物合成且在HS1 vs HT1或HS2 vs HT2中下调，其余包括ABA受体PYL2和3个蛋白磷酸酶2C基因（At3g23360、Os01g0656200和AHG1）参与ABA信号转导。与HS3相比，At3g23360、Os01g0656200和PYL2在HT3中上调。

10个JA相关DEGs中，MYC2和TIFY10A参与JA信号转导且在HS3 vs HT3中上调，其余8个参与JA代谢。At3g11180、LOX3.1、DOX1和CYP94C1（ncbi_122083794）在HT3中上调，OPR11、JMT和CYP94C1（ncbi_122093552）在HS1 vs HT1或HS3 vs HT3中下调。

12个乙烯相关DEGs中，ACS1、ACO和SAMDC4与乙烯生物合成相关，其余如ERF053和ERF113参与乙烯信号转导。ACS1、ERF019、ERF025、ERF035、ERF053和ERF109在HS3 vs HT3中上调，ACO、ERF113和2个ERF095则相反。

4.6 RT-qPCR验证

选取12个激素相关DEGs进行RT-qPCR验证，所有选定基因的表达模式与RNA-seq结果一致，两者间相关系数R2=0.8128，证实RNA-seq数据的可靠性。RT-qPCR进一步揭示AUX22、IAA16、GH3.1、ILL1、GASA1、CKX3、ACO、LOX3.1和TIFY10A在HT中表达水平显著高于HS，而JMT和PILS3则相反。

五、讨论与结论

研究讨论指出，果实脱落是由多种激素信号精确调控的主动过程。生长素（主要是IAA）是负调控植物器官脱落的重要激素，可能参与乙烯的拮抗作用。IAA与乙烯水平之间的平衡是器官脱落过程中的决定性因素。升高的IAA水平降低离区细胞对乙烯的敏感性，从而延迟或抑制脱落。极性生长素运输（PAT）将IAA从果实输送至离区，对维持离区低乙烯敏感性和防止过早落果至关重要。本研究中PIN3和PILS3在HT中下调而PIN1C上调，可能与HT中观察到的较高IAA积累相关，PIN1C的上调可能反映增强的生长素向离区输出，作为维持果实附着的存活信号。

ABA和乙烯通常被视为促进脱落的信号。本研究中HT的ABA含量显著低于HS，ABA生物合成基因（NCED1、LCY1）表达下调，分解代谢基因CYP707A2也降低。ACO的下调和ACS1、SAMDC4的表达改变可能与乙烯生物合成能力的差异相关。GA和CTK是通常促进坐果和果实保留的促生长激素。HT中GA₈和GA₁₉含量高于HS，GA2OX1的下调可能解释了GA₈和GA₁₉的较高水平。CIGR1和GASA1等GA响应基因在HT中的上调表达可能反映有利于果实发育的GA信号状态改变。CTK特别是tZ型对果实生长至关重要，HT中tZ、tZR、tZRMP和IPR含量高于HS，LOGL1和CYP714C2的上调及CKX基因的差异表达表明CTK代谢在果壳中受到活跃调控。

关于JA，HT3中JA、JA-ILE和Me-JA水平高于HS3，伴随LOX3.1、MYC2和TIFY10A表达增加，表明IS果壳在此阶段JA信号增强。这可能反映保护性作用，维持果实对环境胁迫的抗性而非促进脱落。值得注意的是，ABA和乙烯在HT3中下调而JA相关基因上调，提示JA/JA-ILE可能在果壳中拮抗ABA和乙烯诱导的脱落。

综合来看，数据揭示了果壳中伴随IS与IT不同果实保留行为的激素相关转录本和代谢物的协同变化。促生长激素IAA、GA和CTK在HT中普遍上调，而促脱落激素ABA和乙烯下调，JA相关变化则表明生长与防御之间的平衡。研究人员将这些变化解释为与脱落表型相关而非已证实的因果机制，强调所鉴定候选基因的功能作用仍需通过靶向实验验证。极性生长素运输的可能参与为解释观察到的生长素相关转录本和代谢物差异提供了有用框架，但该假设在夏威夷果中的直接检验仍属必要。

研究结论指出，本研究聚焦夏威夷果果壳组织，通过比较转录组学和靶向激素代谢组的整合分析，系统表征了与早期果实脱落相关的分子和生理变化。结果表明，IT与IS截然不同的果实脱落行为伴随着果壳中IAA、GA、CTK、ABA、JA和乙烯生物合成及信号转导的时间性差异。果壳中GA₃、ABA和乙烯的降低以及IAA、tZ和JA/JA-ILE的升高可能与IT的果实保留相关。RNA-seq揭示了HT与HS之间大量参与这六类激素生物合成、代谢和信号转导的基因差异表达。果壳中基于激素的变化可能通过多种激素间的动态互作促成IT的早期果实脱落。本研究鉴定出激素相关DEGs与差异激素代谢物的协同变化，为理解夏威夷果幼果脱落的分子基础提供了见解，尽管这些候选DEGs的功能作用仍有待未来研究验证。这些发现为深入探究夏威夷果早期落果的复杂调控机制提供了基础。