《Sensors and Actuators B: Chemical》：Non-covalent Acrylonitrile-Based Molecular Rotors for Discriminating Soluble Oligomers from Insoluble Protein Aggregates in Live Cells
编辑推荐：
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开发了一种新型的基于丙烯腈的分子转子探针，用于检测蛋白质聚集。
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通过非共价疏水相互作用
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开发了一种新型的基于丙烯腈的分子转子探针，用于检测蛋白质聚集。
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通过非共价疏水相互作用与蛋白质结合，实现无标记、无干扰的成像。
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表现出三相荧光响应，能够区分可溶性寡聚体和不可溶性聚集物。
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提供了一种简单且多用途的工具，用于实时追踪活细胞中的聚集动态。
引言
作为结构复杂且功能多样的生物大分子，蛋白质几乎参与了所有的生物过程[1]。大多数蛋白质通过折叠成定义明确的三维结构而获得功能活性[2]。在各种细胞应力下——如温度波动、pH值变化、氧化损伤或基因突变——蛋白质会失去其天然的三维结构，并逐渐聚集成可溶性寡聚体，最终形成不可溶性聚集物[3],[4]。研究表明，蛋白质的病理性错误折叠及其随后的聚集是许多难治性人类疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病）的病因核心[5],[6],[7]。这些聚集的蛋白质具有独特的生物物理特性，包括局部粘度升高和疏水性改变，这些特性已被用作诊断标志物。
基于荧光的技术由于具有高灵敏度、实时能力和非侵入性[8],[9]，为研究活体系统中的蛋白质聚集提供了独特的优势。迄今为止，已经开发了多种小分子荧光探针。其中，共价标记策略由于其能够将合成染料稳定地、特异性地连接到目标蛋白质上而受到了广泛关注。例如，Halo-tag和SNAP-tag系统依赖于自标记蛋白标签的基因融合，随后进行共价探针偶联[10],[11]。基于合理修饰，张等人开发了一种以绿色荧光蛋白（GFP）为基础的化学工具箱（AggFluor），首次实现了在活细胞中可视化错误折叠的寡聚体和不可溶性聚集物[12],[13]。刘的团队基于基因编码设计了一种人工荧光蛋白作为生物传感器，用于检测活细胞中的蛋白质折叠；这些生物传感器具有优异的生物相容性，并且首次将非荧光蛋白质转化为荧光蛋白质[14]。基于这一概念，我们的团队之前报道了基于查尔酮的共价探针，这些探针在Halo-tag偶联后，能对蛋白质聚集过程中的粘度和极性变化作出响应[15]。另一种共价方法使用马来酰亚胺功能化的探针，它们可逆地与未折叠蛋白质上暴露的硫醇基团结合，产生“开启”荧光信号[16]。最近，我们开发了可以与聚集过程中暴露的亲核残基（例如-SH）发生迈克尔加成的共价探针，从而产生独特的颜色变化，允许可视化聚集物的成熟过程[17],[18]。
尽管取得了这些进展，共价探针仍存在固有的局限性。Halo-tag和SNAP-tag系统不可避免地需要对目标蛋白质进行基因操作（例如与Halo-tag或SNAP-tag融合），这对于天然、未经修饰的蛋白质来说是不可行的。另一方面，基于迈克尔加成的共价探针严重依赖于蛋白质聚集过程中释放的亲核硫醇基团；因此，它们通常无法特异性地检测不含半胱氨酸的病原性蛋白质的聚集[18]。此外，共价偶联可能会改变目标蛋白质的构象动态和聚集途径，而这些探针的不可逆性使得无法监测可逆的聚集-解聚事件。这些缺点突显了迫切需要简单、非共价的荧光探针，能够在不干扰目标蛋白质或无需进行基因工程的情况下灵敏地检测蛋白质聚集。
与共价策略并行，已经开发了多种非共价荧光探针，通过检测微环境变化（如粘度增加或暴露的疏水表面）来检测蛋白质聚集。经典的例子包括Thioflavin T（ThT）、Congo red和某些分子转子，它们在与淀粉样纤维或其他聚集物结合时表现出增强的荧光[19],[20]。尽管这些非共价探针简单且不需要基因操作，但它们存在关键的限制。最显著的是，它们对可溶性寡聚体中间体（聚集过程中的早期且最具毒性的阶段）几乎没有或没有任何响应，只有当形成成熟的不可溶性聚集物时才会强烈荧光[12]。因此，传统的非共价探针无法捕获完整的多步骤聚集过程，特别是从可溶性寡聚体到不可溶性沉积物的转变，从而在我们监测与疾病相关的早期事件方面存在空白。
在这里，我们介绍了一系列基于丙烯腈的荧光分子转子，它们利用非共价疏水相互作用实现蛋白质的自主结合，为检测蛋白质聚集提供了一个干扰最小的平台。该探针通过引入取代的苯环作为电子密度调节基团，实现了可调的粘度敏感性，并表现出显著的三相荧光响应，清晰地区分了可溶性寡聚体和不可溶性聚集物。利用体外聚集实验和活细胞共聚焦成像，我们证明了A5作为一种敏感的“开启”传感器，能够在不需要对蛋白质进行标记或化学修饰的情况下检测蛋白质聚集。这项工作为解读活体系统中的聚集动态提供了多用途的分子工具，对机制研究和诊断开发具有潜在的意义。
部分摘要
材料与试剂
所有试剂均从商业供应商处购买，为分析级，并在使用前无需进一步纯化。所有使用的仪器在补充材料部分有所描述。
基于丙烯腈的探针的通用合成方法
所有化合物的合成和表征均在电子补充材料部分提供。
吸光光谱
使用Agilent Cary 5000 UV/Vis光谱仪收集UV吸光光谱。在室温下准备了10μM的探针溶液（狭缝宽度：3nm）用于测量。所有测试样品
荧光探针设计
蛋白质聚集是一个多步骤过程，伴随着疏水区域的逐渐暴露和局部微粘度的增加。因此，有效的荧光探针应该对这些微环境变化敏感，理想情况下不应干扰天然蛋白质或需要共价偶联。
我们之前报道的基于查尔酮的探针对极性和粘度都具有敏感性；然而，它们依赖于Halo-tag融合
结论
总之，我们开发了一种基于丙烯腈的荧光探针的合理设计策略，通过粘度敏感性来监测蛋白质聚集。这项工作的关键创新在于使用非共价疏水相互作用来实现探针与蛋白质的结合，规避了传统共价标记技术所需的基因操作或特定氨基酸反应性的限制。我们优化的探针A5提供了一种简单且干扰较小的方法
CRediT作者贡献声明
S. Zhang、W. Li和R. Guo进行了实验并分析了数据；Y. Liu进行了密度泛函理论（DFT）计算；S. Yang构思了项目并撰写了初稿；H. Yang构思了项目并编辑了手稿。
CRediT作者贡献声明
Ruimeng Guo： 数据管理。 Yide Liu： 实验研究。 Shuai Zhang： 方法学设计、数据管理。 Wen Li： 实验研究。 Shouning Yang： 初稿撰写、资金获取。 Huayan Yang： 编写、审稿与编辑、监督、资金获取、构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFF0707205）的财政支持。在准备本手稿期间，作者仅使用DeepSeek进行语言润色和语法编辑。作者对输出进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。
Shuai Zhang | Wen Li | Ruimeng Guo | Yide Liu | Shouning Yang | Huayan Yang
