一种可规模化生成人真皮乳头细胞来源类器官的169孔悬滴平台

《Gels》：A 169-Well Hanging-Drop Platform for the Scalable Generation of Human Dermal Papilla Cell-Derived Organoids

刺激性接触性皮炎（ICD）是一种常见的炎症性皮肤病，由直接接触外源性刺激物引起，以皮肤屏障破坏和持续性炎症为特征。本研究开发了一种169孔悬滴平台，用于均一且可规模化地生成人毛囊真皮乳头细胞（HFDPC）来源的类器官。蜂窝状微孔阵列促进重力驱动的细胞聚集并控制类器官形成，而Matrigel提供了富含细胞外基质（ECM）的三维（3D）微环境，支持类组织化组装。与传统基于Matrigel的培养相比，该平台实现了对类器官尺寸和形态的更好控制、可重复的形成以及高通量生产。该平台生成高度均一的类器官，平均直径为116.55 ± 4.36 μm（平均值 ± 标准差），变异系数为3.74%，与标准6孔板整合后可同时生产多达1014个类器官。在ICD小鼠模型中，类器官移植加速了皮肤修复并减轻了炎症，同时伴随氧化应激降低、SirT1表达恢复、PI3K/AKT磷酸化减弱以及Th1/Th17介导的免疫反应受到抑制。这些发现表明，169孔悬滴结构与基于Matrigel的3D微环境的结合为HFDPC类器官的生成提供了一个可控且可规模化的平台，并在ICD小鼠模型中展示了治疗潜力。

刺激性接触性皮炎（ICD）是一种由直接接触外源性刺激物引起的常见炎症性皮肤病，以皮肤屏障破坏和持续性炎症为特征。传统药物治疗虽可缓解炎症症状，但长期反复用药存在快速耐受及药物特异性不良反应，且停药后复发率高，其原因在于单纯抗炎治疗并不能修复受损的表皮屏障。为克服上述局限，细胞治疗等再生治疗策略受到关注，其中三维（3D）细胞聚集体（如球状体或类器官）因能再现天然细胞微环境的某些方面而颇具前景。人毛囊真皮乳头细胞（HFDPC）因其再生与免疫调节特性成为有吸引力的候选细胞。然而，传统类器官培养技术受限于培养效率低、操作繁琐以及类器官尺寸和形态的变异性，现有悬滴、微孔、微流控和3D生物打印等平台在操作简便性、高通量生产与均一性之间难以兼顾。为此，研究人员开发了一种169孔悬滴平台，在基于Matrigel的3D微环境中简单、可重复地生成HFDPC类器官，并评估其促进皮肤再生的治疗潜力。本研究中，类器官被操作性地定义为Matrigel支持的、自组装的HFDPC聚集体，具有内部腔样结构、增强的ECM沉积和有组织的细胞骨架等独特三维结构特征，并保留真皮乳头相关特征和增强的TGF-β信号；而球状体指同一平台中无Matrigel条件下形成的单纯重力驱动细胞聚集体。与既往悬滴或基于Matrigel的方法相比，该平台的独特之处在于结合了单步细胞加载、原位换液、无需去除基质即可直接收获类器官、高尺寸均一性以及与标准6孔板的兼容性（可同时生产多达1014个类器官）。将生成的HFDPC类器官移植到ICD小鼠模型后，其促进皮肤再生并减轻炎症反应，支持其在炎症性皮肤病中的治疗潜力。总体上，该169孔悬滴平台将Matrigel提供的3D ECM环境与受控的类器官形成相结合，为HFDPC类器官生成及ICD等炎症性皮肤病的细胞治疗提供了一种简单、可规模化且可重复的策略。

在关键技术方法方面，研究人员采用计算机数控（CNC）铣削加工铝质和丙烯酸酯主模具，经软光刻（soft-lithography）和PDMS双铸造成型制备169孔悬滴平台（每孔0.5 mm直径、2.0 mm深度、1.5 mm孔间距，单滴2 μL，单次加载2 mL细胞悬液）；以每微孔3000个细胞的密度接种HFDPC（购自PromoCell，C-12071，第8–10代），在含1.5% Matrigel和0.24% Methocel的培养基中培养3天生成类器官，无Matrigel条件下生成球状体；通过慢病毒转导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记细胞；采用HE染色、免疫荧光、qRT-PCR、Western blotting和ELISA进行结构与分子表征；建立反复胶带剥离诱导的C57BL/6J小鼠ICD模型（每组n = 6，所有组每日腹腔注射环孢素A 10 mg/kg以抑制异种移植免疫排斥），经皮内注射单层HFDPC、球状体或类器官（均相当于1.5 × 10⁵个细胞），于第7天评估皮炎严重度评分（DSS）、表皮厚度、DHE染色活性氧（ROS）、流式细胞术（FACS）分析脾细胞T细胞亚群及皮肤组织Western blotting。

研究结果方面：2.1 利用169孔悬滴平台生成HFDPC类器官。该平台由蜂窝状微孔阵列构成，借助重力驱动细胞聚集，无需外部设备即可形成尺寸均一的类器官；单次加载2 mL细胞悬液即可自发分布并在全部169个悬滴孔中形成悬滴，无需逐孔移液。与将细胞包埋于浓缩Matrigel液滴的传统培养不同，本研究在每滴中以低浓度（1.5%）将Matrigel加入培养基，兼顾ECM支持与悬滴平台的尺寸控制，且类器官可直接收获而无需额外去除基质步骤。平台生成的HFDPC类器官平均直径为116.55 ± 4.36 μm、变异系数（CV）为3.74%，显著大于球状体（95.42 ± 11.44 μm，CV 11.99%）；6个独立培养平台中超过90%的孔成功生成单个类器官，3天培养期间蒸发导致的体积损失约3%，阵列中心与边缘区域类器官直径无显著位置差异；共评估1014个微孔，约90%的接种孔在培养3天后获得单个完整类器官，所有形成的类器官均成功回收（回收效率100%）。组织学分析显示类器官形成具有内部腔样结构的有组织架构，而球状体为较致密的细胞聚集体；免疫荧光显示类器官中纤连蛋白（fibronectin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和碱性磷酸酶（ALP）表达明显，定量分析显示类器官ALP活性和versican分泌显著高于单层培养和球状体；qPCR、Western blotting和ELISA显示类器官中TGFBR2 mRNA和蛋白表达及TGF-β2分泌显著高于球状体和单层培养，提示3D微环境增强了HFDPC对TGF-β信号的内在反应性。2.2 HFDPC类器官对氧化应激的调控。在ICD小鼠模型中，类器官移植明显改善ICD临床表现、减少皮肤病变，HE染色显示表皮增生和炎症细胞浸润减轻，DHE染色显示炎症皮肤中ROS蓄积显著减少；重复测量双因素方差分析显示治疗（p < 0.001）和时间（p < 0.001）效应显著，类器官组自第4天起DSS显著低于ICD + 生理盐水组，且显著低于HFDPC单层和球状体组；类器官组表皮厚度和DHE荧光强度的降低幅度均显著大于单层和球状体组。机制上，类器官移植后SirT1表达显著恢复，ICD皮肤中升高的PI3K和AKT磷酸化明显减弱，BAX/BCL-2比值显著降低，提示抗氧化与再生效应与SirT1-PI3K/AKT信号通路调控及凋亡相关组织损伤减轻有关（作者指出未进行通路抑制或 rescue 实验，上述关系为相关性而非因果中介）。2.3 抑制JAK2/STAT3介导的炎症信号。Western blotting显示ICD + 类器官组HMGB1/β-actin显著低于ICD + 生理盐水组，pJAK2/JAK2比值显著低于ICD + HFDPCs和ICD + Spheroids组且与正常组无统计学差异，pSTAT3/STAT3比值较ICD + 生理盐水组降低约50%并显著低于单层和球状体组，COX-2/β-actin显著降低且与正常组无显著差异，而单层HFDPC或球状体处理未产生显著降低，提示类器官可抑制HMGB1/JAK2/STAT3介导的炎症信号。2.4 调节Th1/Th17介导的免疫反应。脾细胞流式分析显示，与ICD + 生理盐水组相比，单层HFDPC或球状体处理未显著改变CD4⁺IL-17⁺细胞比例，而类器官处理显著降低该群体并显著低于单层和球状体组；类器官处理还显著降低CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺细胞比例，其中CD8⁺IFN-γ⁺细胞恢复至与正常脾脏无统计学差异的水平。皮损组织Western blotting显示IL-17A蛋白表达在单层、球状体和类器官组中依次显著降低，IFN-γ蛋白表达在类器官组显著低于球状体组。作者指出所有实验组均接受相同方案的环孢素A（10 mg/kg）以抑制异种移植排斥，其可能影响脾脏系统免疫和皮肤局部炎症反应，故上述差异应解释为伴随免疫抑制条件下的治疗相关免疫调节效应。2.5 局限性。Matrigel为肿瘤来源、组成可变且批次间存在差异的基质，其可追溯性有限，限制临床转化，需无异源或重组替代物；治疗效果仅在短期（7天）ICD模型及全身环孢素A免疫抑制下得到验证，需在免疫健全模型中验证；机制发现为相关性，未进行通路抑制或 rescue 实验，也未评估下游TGF-β/SMAD读数（如SMAD2/3磷酸化和核转位）；仅使用单一商业化HFDPC细胞系，未涉及供者间差异。因此，现有结果尚不能确立对人类炎症性皮肤病的治疗就绪性。

讨论与结论部分总结：本研究开发了可重复且可规模化生成HFDPC类器官的169孔悬滴平台。与HFDPC单层培养和球状体相比，所生成类器官在体外表现出更高的结构复杂性及TGF-β相关分子特征（TGFBR2表达和TGF-β2分泌增加），但未直接确认通路激活。移植到ICD小鼠模型后，HFDPC类器官显著降低HMGB1和COX-2蛋白表达以及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值，降低BAX/BCL-2比值，同时SirT1表达显著恢复；大体和组织学分析进一步显示皮肤炎症减轻和组织再生增强，支持HFDPC类器官治疗ICD的潜力。与HFDPC单层治疗相比，基于HFDPC类器官的策略可能为皮肤再生提供一种替代性3D途径。鉴于Matrigel的肿瘤来源和批次间变异性，未来研究可评估无异源或重组基质作为潜在替代物以提高批次一致性和临床可转化性。HFDPC类器官的治疗效果是在环孢素A免疫抑制下的短期ICD小鼠模型中证实的，且机制发现为相关性；在临床转化前尚需在免疫健全模型中进行验证、开展长期安全性评价和机制干预研究。