《Cells》：CRISPR-Based Engineering of Mesenchymal Stem Cells: Functional Enhancement, Translational Challenges, and Clinical Perspectives
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间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有再生和免疫调节治疗前景的平台，但其临床性能受限于供体异质性、可变效力和有限的持久性。基于CRISPR的工程化通过基因组编辑和转录调控提供了可编程的方法来修饰MSC功能。本综述考察了C
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有再生和免疫调节治疗前景的平台，但其临床性能受限于供体异质性、可变效力和有限的持久性。基于CRISPR的工程化通过基因组编辑和转录调控提供了可编程的方法来修饰MSC功能。本综述考察了CRISPR/Cas9介导的敲除和敲入、基于dCas9的转录调控以及新兴的碱基编辑（base editing）、先导编辑（prime editing）和表观基因组编辑（epigenome editing）技术在MSC工程化中的应用。这些方法能够增强存活与应激抵抗、归巢与组织滞留、旁分泌与外泌囊泡活性、免疫调节、免疫相容性以及谱系相关功能。关键的转化挑战包括高效递送、工程化群体异质性、基因组安全性、免疫原性、表型稳定性、可规模化生产以及与机制相关的效力评估。因此，应根据预期的治疗机制和产品开发需求选择合适的工程化策略。临床转化的最终取决于能否证明可重复的功能增强、生产一致性、基因组和表型稳定性以及经过验证的治疗效力。
1. 引言
间充质干细胞（MSCs）因其免疫调节、旁分泌和组织修复特性被视为有前景的治疗平台。然而，临床性能可能受到供体和组织来源异质性、传代依赖性表型变化、可变功能效力和给药后有限持久性的影响。传统的预处理方法可能改变MSC分泌组的某些成分，而基于CRISPR/Cas的工程化提供了一种可编程的方法来修饰特定基因和调控通路。CRISPR/Cas9可用于永久性基因破坏或靶向序列修饰，但双链断裂（DSB）基础的编辑引发了关于脱靶切割、DNA损伤反应和离体扩增期间基因组稳定性的额外担忧。同时，在原代MSCs中递送仍具挑战性，并且在持续编辑器表达的情况下，细菌Cas蛋白的免疫识别可能相关。因此，CRISPR激活（CRISPRa）利用核酸酶失活的Cas9（dCas9）在不诱导DSB的情况下上调内源基因座的转录，当治疗效益可以通过增加基因表达而不进行永久性序列改变来实现时，这是一种互补策略。本综述对基于CRISPR的MSCs工程化策略进行了批判性评估，并将基因组编辑和转录调控与功能增强、递送和生产中的挑战、安全性、效力、监管转化和疾病特异性应用联系起来。
2. CRISPR工程化策略用于MSCs
2.1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑
经典的CRISPR/Cas9基因组编辑系统主要由Cas9核酸内切酶和单链引导RNA组成，后者将核酸酶引导至互补的基因组序列。靶标识别需要原型间隔区相邻基序（PAM），通常为5‘-NGG-3’。识别PAM后，局部DNA解旋使sgRNA间隔序列与互补DNA链杂交，形成RNA-DNA异源双链体和相关的R环结构，从而稳定Cas9-DNA复合物。随后，Cas9的两个催化结构域发生构象激活，产生位点特异性的DSB。DSB通过非同源末端连接（NHEJ）修复通常产生小的插入或缺失，可破坏编码序列并实现基因敲除，而同源定向修复（HDR）在提供适当供体模板时可被利用来引入确定的序列改变。CRISPR/Cas9相较于锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶的主要优势在于将靶标识别与核酸酶蛋白重新设计分离。这种模块化也促进了多重编辑。然而，DSB形成也带来了潜在的安全隐患，如脱靶效应和DNA损伤反应的激活。
2.2. NHEJ和HDR作为MSCs中CRISPR编辑结果的决定因素
Cas9诱导的DSB后，最终编辑结果主要由细胞DNA修复机制决定。NHEJ不需要外部同源DNA模板，在哺乳动物细胞周期的大部分阶段均有活性，常用于基因敲除应用。HDR则遵循根本不同的机制，利用同源序列信息重建受损基因座，支持精确的序列替换或插入，但与S和G2细胞周期阶段密切相关。在原代MSCs中已实现了精确的靶向整合，例如通过Cas9核糖核蛋白与腺相关病毒血清型6供体模板联合递送，在不同MSC来源中获得了不同效率的靶向整合。NHEJ和HDR应被视为互补而非竞争机制，编辑策略应根据预期作用机制、所需修饰持续时间、可接受的基因组风险和下游生产要求来选择。
2.3. 基于dCas9的转录调控与CRISPR激活
催化失活的Cas9通过灭活Cas9的核酸酶结构域产生，保留了通过sgRNA识别特定基因组位点的能力，但消除了DNA切割活性，从而将Cas9转化为可编程的DNA结合支架。当dCas9与转录激活因子融合时，该系统称为CRISPR激活。CRISPRa不有意改变靶基因的核苷酸序列，而是招募转录机器到启动子或调控区域，从内源基因座增加转录，而不诱导DSB。早期系统使用dCas9与VP64激活结构域融合，后来的平台如dCas9-VPR和协同激活介质系统增强了转录活性。CRISPRa的一个主要概念优势是基因表达从内源基因组位点激活，而不是从单独引入的cDNA盒表达。CRISPRa不引起Cas9诱导的DSB，因此绕过了依赖DNA断裂的修复和靶标处indel形成的可能性。在MSC工程化中，当治疗改善可通过增加内源通路活性而非永久修改DNA序列来实现时，转录调控具有相关性。
2.4. 为MSCs选择合适的CRISPR工程化策略
CRISPR工程化方式的选择应由实现预期治疗作用机制所需的生物学改变来决定。标准Cas9介导的编辑在需要永久性序列改变时最有用，而基于dCas9的转录调控可能更适合于可通过上调或下调内源基因表达而不永久修改DNA序列来实现所需表型的情况。最佳策略还取决于所需治疗效果的长度和幅度。CRISPR基础的MSC工程化应被视为一个从永久基因组修饰到可逆或可调基因调控的可编程干预谱系。
3. MSCs的功能增强
CRISPR基础的工程化提供了修改MSCs特定生物学特性的机会，这些特性影响其治疗性能。主要的工程化目标可分为存活和应激抵抗、归巢和组织滞留、旁分泌和外泌囊泡活性、免疫调节和免疫相容性，以及谱系或基质相关功能。
3.1. 存活和应激抵抗
给药后有限的存活是MSC疗法的重要限制。基因破坏代表一种提高MSC存活的方法，如通过CRISPR/Cas9介导的KEAP1破坏增强抗氧化防御和缺血模型中的血管再生。转录激活提供了另一种选择，如通过CRISPRa激活PDGFR-β提高存活和旁分泌活性。重要的是，改善的细胞存活不应自动解释为改善的治疗效力。
3.2. 归巢、迁移和组织滞留
MSC迁移受趋化因子梯度、粘附分子以及与血管和细胞外基质组分相互作用的影响。CXCR4-SDF-1α轴是研究最广泛的MSC归巢通路之一。另一项记录在案的CRISPR策略是通过Cas9-AAV6介导的PSGL-1和FUT7敲入改善血小板相互作用、粘附和向受伤皮肤的归巢。
3.3. 旁分泌、血管生成和外泌囊泡功能
许多归因于MSCs的治疗效应是通过旁分泌信号介导的。CRISPR基础的工程化可用于改变这些分泌产物的数量或组成。血管生成增强提供了一个代表性例子。CRISPRa介导的TSG-6激活与MSC衍生外泌囊泡的活性和货物变化相关。
3.4. 免疫调节和免疫相容性
MSCs的免疫工程化可服务于两个不同的目的：增强MSCs调节受体免疫反应的能力，以及减少对MSC产品本身的免疫识别。治疗性免疫调节可通过修饰抗炎或免疫调节通路来增强。免疫相容性工程化侧重于减少对给药MSCs的识别，如通过B2M和CIITA相关机制的修饰。然而，经典MHC I类分子的丢失可能增加对自然杀伤细胞的易感性。
3.5. 谱系和基质相关功能
CRISPR基础的工程化也可用于修改MSC分化和细胞外基质相关功能，特别是在肌肉骨骼和再生医学应用中。分化相关的转录调控因子提供了几个潜在的工程化靶点。对于谱系导向的应用，成功的编辑应使用功能性分化和基质质量终点进行评估。
4. 递送和生产挑战
4.1. 将CRISPR组分递送入MSCs
高效的细胞内递送仍然是原代MSCs中CRISPR工程化的主要实际障碍之一。物理形式的CRISPR货物影响编辑器暴露的持续时间和潜在生物学后果。电穿孔和核转染是最广泛使用的非病毒递送方法，但也可能引起膜损伤、应激反应或活力丧失。病毒载体在许多原代细胞环境中具有更高的递送效率，但有不同的转化考虑因素。慢病毒载体适合稳定的dCas9基础调控系统，但存在插入相关和长期表达问题。腺相关病毒主要作为非整合型供体模板递送平台，但其包装容量限制了大型多组分CRISPRa系统的适用性。
4.2. 工程化MSC群体的稳定性和异质性
工程化原代MSCs引入了超出供体特征、组织来源、培养条件和传代历史固有异质性的变异性。稳定的CRISPRa系统引入了与调控盒持久性和表观遗传沉默相关的额外担忧。群体异质性对于CRISPRa尤其相关，因为转录反应可根据激活因子丰度、sgRNA表达、染色质可及性和细胞状态而变化。
4.3. 生产可扩展性和群体一致性
临床转化需要在生产规模上可重复实施的工程化策略。起始组织选择是一个主要的过程变量。骨骨髓来源的MSCs具有完善的临床生产历史，脂肪来源的MSCs可能提供更易获取的起始材料，而脐带来源的MSCs提供围产期同种异体来源。群体一致性也应相对于MSC特性和治疗功能进行评估。
4.4. 递送和生产的转化优先事项
未来CRISPR工程化MSC平台的开发应将递送性能与最终治疗产品的需求相结合。非整合型递送对于瞬时核酸酶编辑仍然特别有吸引力，并应针对更大的转录调控货物进一步优化。递送效率应被视为一个过程属性，而不是孤立的成功衡量标准。
5. 安全性、免疫原性和长期稳定性
5.1. 脱靶编辑和基因组完整性
脱靶活性发生在CRISPR核酸酶切割非预期基因组位点时。潜在后果包括小插入或缺失、更大结构改变和DNA损伤反应的激活。几种互补方法可以提高编辑精度，包括高保真Cas9变体、化学修饰的sgRNAs、配对切口酶和诱导型核酸酶系统。
5.2. 免疫原性和免疫逃逸工程化
CRISPR工程化MSCs的免疫识别可能来自几个不同的来源。细菌Cas蛋白可能被预先存在的抗体或T细胞识别。免疫逃逸工程化已被研究作为减少同种异体识别的策略。然而，MHC I类表达的减少引入了重要的生物学权衡，因为低MHC I类表达的细胞可能更容易受到NK细胞介导的“自我缺失”识别。
5.3. 持久性、衰老和长期安全性
工程化MSC产品的预期持久性取决于其预期治疗机制。增强凋亡抵抗可能延长MSC活性持续时间，但长期存活也可能增加意外效应的暴露。组织来源、传代数、培养历史和编辑后选择也会影响工程化表型的持久性。当使用持久性工程化细胞或整合构建体时，可以考虑额外的安全机制，如诱导型杀伤开关系统。
6. 效力和监管转化
6.1. CRISPR工程化MSCs的监管考量
离体扩增MSCs的体细胞基因组工程引入了超越传统MSC产品的额外表征要求。国际人类基因组编辑治理框架强调监督、可追溯性、风险基础评估和长期考量。FDA批准的同种异体骨髓来源MSC产品remestemcel-L-rknd提供了一个重要示例，但不应将其解释为建立了CRISPR工程化MSCs的直接监管路径。
6.2. 功能性效力评估
效力测试代表了工程化MSC产品的核心挑战，因为分子编辑的确认本身并不证明治疗活性。机制关联的效力策略应建立预期分子修饰与治疗适应症相关生物活性之间的关系。最终的效力测定应反映预期的作用机制，并足够可重复以支持可比性和生产控制。
6.3. 分泌组和外泌囊泡考量
如果基因工程用于改变MSCs的分泌组或外泌囊泡输出，效力评估需要额外考量。MISEV2023为外泌囊泡的表征和报告提供了当代框架，但这些参数本身并不确立治疗效力。
7. 针对特定疾病的应用
7.1. 心血管和缺血性疾病
心血管和缺血模型展示了工程化多种互补MSC功能的潜在价值。在人类骨髓来源MSCs中，CRISPR/Cas9介导的KEAP1敲除增强了氧化应激保护并改善了小鼠肢体缺血模型中的灌注。CRISPRa介导的PDGFR-β激活改善了存活、旁分泌活性和糖尿病伤口愈合。
7.2. 肌肉骨骼和软骨修复
肌肉骨骼应用更加强调谱系调控、基质形成和对不良分化的控制。CRISPR/Cas9介导的RUNX2敲除已在工程化软骨基质中得到研究，而dCas9介导的SOX9激活结合PPARγ抑制增强了软骨形成和颅骨再生。
7.3. 炎症和免疫介导疾病
MSC疗法经常因其调节炎症和免疫反应的能力而被研究。CRISPR基础的工程化提供了通过修饰内源性免疫调节通路来增强这些功能的机会。减少同种异体MSC产品中免疫识别是一个相关但不同的目标。
7.4. 神经和肿瘤疾病
MSCs的神经学应用与旁分泌和外泌囊泡介导的机制密切相关。肿瘤学应用涉及一个本质上不同的治疗概念，MSCs作为抗肿瘤因子递送载体被研究，但需要谨慎评估其促肿瘤潜能。
8. 未来方向和新兴技术
8.1. 超越双链断裂的碱基编辑和先导编辑
碱基编辑和先导编辑提供了无需依赖常规Cas9诱导DSB的精确基因组修饰替代策略。这些方法可能特别适用于原代MSCs，因为它们减少了对在缓慢增殖细胞中效率较低的HDR的依赖。
8.2. 表观基因组编辑和下一代基因调控
未来的MSC工程化也可能扩展到超越常规基因激活，朝向对内源性调控网络的更复杂控制。dCas9可与转录抑制因子、染色质修饰酶或其他调控结构域偶联，以在不直接切割DNA的情况下改变基因活性。
9. 结论
CRISPR基础的工程化提供了修改MSC存活、迁移、旁分泌活性、免疫调节特性和谱系相关功能的互补策略。尽管取得了这些进展，目前的证据主要是临床前水平的，几个障碍继续限制临床转化。未来的开发应侧重于将工程化方式与明确定义的治疗机制相匹配，同时证明所得MSC产品可以可重复地生产并维持适当的安全性、稳定性和功能效力。
