《Cells》：Enhancement of Cisplatin Efficacy by the Histone Demethylase Inhibitor JIB-04 in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) Cell Lines
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头颈鳞状细胞癌（HNSCC）对顺铂产生耐药。研究人员探究了Jumonji组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04是否增强已建系的HNSCC细胞系中顺铂的活性。研究采用四种来源于原发肿瘤及配对淋巴结转移灶的UT-SCC细胞系，单独或联合给予JIB-04与顺铂处理。通过
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）对顺铂产生耐药。研究人员探究了Jumonji组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04是否增强已建系的HNSCC细胞系中顺铂的活性。研究采用四种来源于原发肿瘤及配对淋巴结转移灶的UT-SCC细胞系，单独或联合给予JIB-04与顺铂处理。通过MTT法评估细胞活力，并采用Highest Single Agent（HSA）模型评价药物相互作用。在UT-SCC-24A细胞中，评估了BrdU掺入、LDH释放、细胞周期分布及细胞凋亡。在功能实验相同药物浓度下处理24 h后进行RNA测序。JIB-04在亚微摩尔浓度下降低所有HNSCC细胞系的活力，对BJ成纤维细胞作用温和。HSA分析在UT-SCC-24A中识别出局部正向相互作用，总体HSA评分为4.25，而局部评分在狭窄的低剂量范围内达到约16–18。联合处理进一步降低DNA合成并增加S/G2-M期蓄积及细胞凋亡，而未显著增加LDH释放。RNA测序显示JIB-04相关诱导综合应激反应/ATF4及DNA损伤反应相关基因，同时抑制增殖和细胞周期相关基因。联合处理保留了这些转录特征。上述发现支持在特定HNSCC细胞系模型中进一步研究JIB-04–顺铂联合方案。
**研究背景与意义**
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球常见的恶性肿瘤之一，顺铂（cisplatin）仍是其治疗的重要组成药物，但耐药性的产生显著限制了疗效。顺铂诱导的DNA损伤可干扰DNA复制并激活DNA损伤反应、细胞周期检查点及最终导致细胞死亡的信号通路。然而，肿瘤细胞对顺铂的响应具有异质性，可能受细胞内药物蓄积减少、DNA损伤耐受或修复增强以及促生存程序激活等因素影响。既往研究显示，在HNSCC细胞模型中，二手烟提取物暴露与顺铂内流转运体CTR1表达降低、ABCG2和ATP7A表达升高以及顺铂响应减弱相关，这些观察结果共同说明了顺铂耐药机制的复杂性，并支持探索可能改变治疗响应的化合物。
表观遗传调控因子在此背景下受到关注，因其参与调控增殖、DNA损伤反应、应激适应和细胞存活相关的转录程序。组蛋白赖氨酸甲基化由赖氨酸甲基转移酶和组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDM）共同调控。多个KDM家族成员与HNSCC生物学相关并已被作为药理学靶点进行研究。然而，单个酶在顺铂响应中的作用尚未完全阐明，且使用KDM靶向化合物后观察到的效应若无直接的靶点结合证据，则不能归因于特定去甲基化酶。JIB-04是一种小分子化合物，据报道可抑制多种含Jumonji C结构域的组蛋白去甲基化酶，包括KDM4和KDM5家族成员。具有跨多个KDM活性的化合物为探索单一酶抑制可能无法捕捉的细胞响应提供了途径；同时，这种较广泛的药理学特征使得区分JIB-04处理效应与已证实的KDM依赖性机制变得尤为重要。
非HNSCC模型中的研究为评估JIB-04联合顺铂提供了进一步依据。JIB-04在肝细胞癌细胞中与增殖受损和细胞周期进程阻滞相关，在Ewing肉瘤细胞中与致癌转录程序失调和DNA损伤增加相关。在MECOM扩增的卵巢癌模型中，JIB-04也被报道可改善顺铂响应。这些发现提示JIB-04可影响与细胞毒性治疗响应相关的多个过程，同时强调其 underlying 通路和效应幅度可能取决于肿瘤背景。
近年来关于JIB-04在HNSCC中的临床前证据有所增加。Dorna等人在FaDu和SCC-040细胞中评估了包括JIB-04在内的多种KDM靶向化合物联合顺铂和/或PARP抑制剂olaparib的效果。JIB-04显示出显著的單药活性，而联合处理的响应在两种细胞系间存在差异。该研究还报道了包含全部三种药物的方案具有显著效应。在另一项研究中，JIB-04联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂panobinostat降低了FaDu和SCC-152细胞的活力，并与凋亡和DNA损伤相关读出指标的变化相关。最近，Dorna等人考察了包括JIB-04在内的KDM靶向化合物对HNSCC细胞生长和顺铂响应的影响，涉及二维和三维培养模型。上述研究共同确立了在HNSCC中研究含JIB-04联合方案的理论基础，同时表明治疗响应不能假定在不同细胞模型间具有一致性。
上述既往研究未涉及本研究所使用的配对UT-SCC-24A/24B和UT-SCC-42A/42B细胞系。此外，尽管功能结局和选定分子标志物已被研究，但对早期转录响应的更广泛表征有助于识别在顺铂暴露背景下与JIB-04处理相关的应激和细胞周期相关程序。因此，研究人员比较了JIB-04和顺铂在这些来源于原发肿瘤及配对淋巴结转移灶的已建系细胞系中的效应。在UT-SCC-24A中——该细胞系基于Highest Single Agent分析中的局部正向相互作用而被选为进一步研究对象——研究人员将功能实验与处理24 h后进行的RNA测序相结合。该方法使研究人员能够检查基因表达的早期变化是否与后续DNA合成、细胞周期分布和细胞凋亡的效应一致，以及联合处理是否引发超出单药处理相关的转录效应。所获得的关联旨在产生机制性假设，而非确立任何转录通路的因果作用或证明对特定KDM的抑制。
**关键技术方法**
研究采用四种来源于原发肿瘤及配对淋巴结转移灶的UT-SCC细胞系（UT-SCC-24A、UT-SCC-24B、UT-SCC-42A、UT-SCC-42B，均为HPV阴性HNSCC模型，来源于芬兰Turku大学中心医院）以及BJ正常人皮肤成纤维细胞系（购自ATCC）。通过MTT法评估细胞活力并计算IC
50；采用SynergyFinder 3.0结合HSA参考模型分析药物相互作用；通过BrdU ELISA检测DNA合成；以LDH释放实验评估细胞毒性；利用NucleoCounter NC-3000系统进行细胞周期分析和Annexin V/PI凋亡检测；通过RT-qPCR检测凋亡及上皮–间充质转化（EMT）相关基因表达；在处理24 h后进行RNA测序及生物信息学分析（DESeq2差异表达分析、基因集富集分析、主成分分析）。
**研究结果**
**JIB-04与顺铂降低HNSCC细胞活力**：通过MTT法对四种HNSCC细胞系进行72 h处理，顺铂在均显示浓度依赖性活力下降，UT-SCC-24A最为耐药（IC
50 = 13.87 μM），UT-SCC-24B在较低浓度下活力下降最显著。JIB-04在所有肿瘤细胞系中均呈剂量依赖性活力降低，即使在亚微摩尔浓度下亦然，UT-SCC-24B最为敏感。UT-SCC-24A中JIB-04的IC
50估计为0.30 μM。JIB-04在BJ皮肤成纤维细胞中的响应较弱，但因BJ成纤维细胞非组织匹配的上皮对照，该数据未用于推断肿瘤选择性。
**联合分析识别局部正向HSA相互作用**：通过浓度矩阵结合SynergyFinder 3.0和HSA模型分析，UT-SCC-24A总体HSA评分为4.25，反映中等正向相互作用；效应集中于狭窄区域，在0.075 μM JIB-04联合6.935–13.87 μM顺铂时局部HSA评分达约16–18。研究人员因此将其描述为局部正向相互作用而非跨矩阵的广泛增强效应。后续分析选用0.075 μM JIB-04联合6.935 μM顺铂（该区域较低顺铂浓度）以保留可测量的响应范围。
**联合处理进一步降低DNA合成**：通过BrdU ELISA检测UT-SCC-24A细胞，单独JIB-04或顺铂处理均显著降低BrdU掺入，联合处理较任一单药进一步降低BrdU掺入，表明所选浓度下DNA合成受到更大抑制。
**JIB-04与顺铂联合处理未显著增加LDH释放**：72 h处理后，对照组与各处理组间LDH释放无统计学显著差异。尽管顺铂及联合处理组LDH释放数值上高于对照，但差异未达统计学显著性。该结果不应解释为无膜损伤的证据。
**联合处理改变UT-SCC-24A细胞周期分布**：通过NC-3000系统分析，JIB-04单独处理使G2/M期细胞比例较未处理对照增加约两倍；顺铂单药诱导S期和G2/M期蓄积；联合处理进一步加剧顺铂诱导的变化，S期和G2/M期比例更高，G1期比例降低。
**联合处理增加UT-SCC-24A细胞凋亡**：Annexin V/PI染色显示，顺铂或JIB-04单独处理均较未处理对照增加早期和晚期凋亡细胞比例，JIB-04单独处理与晚期凋亡比例增加相关。联合处理较任一单药活细胞比例更低、Annexin V阳性细胞比例更高。
**联合处理改变凋亡及EMT相关基因表达**：通过qPCR检测，顺铂增加CASP3、CASP9、BAX和BCL2 mRNA表达（BAX约增加两倍，BCL2约增加3.5–4倍）；联合处理组BAX mRNA水平与顺铂单药相似，而BCL2 mRNA较低；JIB-04单独处理对CASP3和CASP9转录水平影响甚微。联合处理组较低的BCL2表达联合持续的BAX表达与更高的促凋亡BAX/BCL2转录比值相关，与Annexin V/PI检测到的凋亡细胞比例增加一致。EMT相关基因方面，顺铂增加VIM和TWIST1表达，JIB-04单独处理轻微增加CDH1表达并降低VIM和SNAI1表达；联合处理下VIM和TWIST1相对未处理对照仍保持升高。
**UT-SCC-24A细胞对JIB-04、顺铂及其联合的早期转录响应**：处理24 h后进行RNA测序，联合处理与JIB-04和顺铂单药均显著不同（padj < 0.05时分别为6358和5098个基因；|log2FC| > 1时分别为1041和434个基因），转录谱以顺铂响应为主。主成分分析中联合处理位于接近两药加性效应预期位置，偏差相当于联合向量的18%，且沿顺铂轴（PC1）的位移超出预期。在基因水平，11,463个经过滤保留的基因中894个检测到统计学显著的药物相互作用（p < 0.05），其中32个绝对相互作用log2FC > 1；可评估相互作用的766个差异表达基因中，600个（78.3%）无统计学显著相互作用，166个（21.7%）显示显著相互作用。50个Hallmark基因集中23个检测到对加性预期的显著偏离。基因集富集分析显示，JIB-04处理与应激和炎症响应程序激活相关，包括TNFα通过NF-κB信号、炎症反应、未折叠蛋白反应和缺氧相关基因集，同时增殖相关基因集富集降低，包括E2F靶点、G2/M检查点和MYC靶点。基因水平上，JIB-04增加综合应激反应/ATF4相关基因表达，包括ASNS、DDIT3、GDF15、SLC7A11、TRIB3、CHAC1、XBP1和SESN2。顺铂处理与DNA损伤和应激相关程序富集相关，包括DNA修复、UV响应、干扰素响应和p53通路，同时降低G2/M检查点、有丝分裂纺锤体和EMT基因集富集，并降低多个有丝分裂和增殖相关基因表达，包括CCNB1、AURKA和PLK1。联合处理保留了JIB-04相关的综合应激反应和顺铂相关的DNA损伤反应，与TNFα通过NF-κB信号、UV响应、p53通路、炎症反应和干扰素-γ响应激活相关，同时G2/M检查点、有丝分裂纺锤体、UV响应DN和E2F靶点基因集富集降低。联合处理下ASNS、DDIT3和GDF15表达仍升高，CDKN1A表达高于任一单药处理。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究考察了JIB-04和顺铂在四种来源于原发HNSCC肿瘤及配对淋巴结转移灶的UT-SCC细胞系中的效应。两种化合物作为单药均降低MTT信号，但响应幅度和浓度依赖性在细胞系间存在差异。HSA模型分析在UT-SCC-24A中识别出中等正向总体相互作用（HSA评分4.25，按预设标准归类为加性），局部HSA评分高于10仅限于0.075 μM JIB-04联合6.935–13.87 μM顺铂的狭窄浓度区域（按预设标准归类为协同）。因此，该相互作用应解释为局部正向或局部协同相互作用，而非跨全剂量矩阵或所有HNSCC细胞系的广泛协同效应。UT-SCC-24A因包含最高正向HSA评分的浓度区域而被选为后续分析对象，机制实验旨在表征对该选定联合方案的细胞响应，而非确立跨HNSCC模型的顺铂增敏通用机制。在所选浓度下，联合处理较任一单药与更大的MTT信号降低和BrdU掺入减少相关；BrdU实验显示联合处理下DNA合成减少，但未用于计算相互作用评分，因此不能独立确立药理学协同。细胞周期分析显示JIB-04单独增加G2/M群体，顺铂增加S和G2/M期比例，联合处理较顺铂单药进一步增加S和G2/M期比例并降低G1群体。Annexin V/PI染色显示联合处理后活细胞比例更低、凋亡细胞比例更高。相比之下，72 h后LDH释放未显著增加，该结果不应解释为无膜损伤的证据，而是未检测到LDH释放增加。24 h后RNA测序分析提供了72 h功能终点之前的早期转录响应视图。主成分分析显示处理组间清晰分离，顺铂占转录组变异的最大成分，JIB-04产生不同的次要位移。JIB-04和顺铂与不同的转录程序相关。联合处理保留了两种单药处理的主要特征，包括JIB-04相关的应激响应特征和顺铂相关的DNA损伤及细胞周期相关变化。此外，联合处理下CDKN1A表达高于任一单药。CDKN1A编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，是经典的p53靶点，参与细胞周期阻滞；然而CDKN1A也可通过p53非依赖性应激响应通路诱导。由于UT-SCC-24A已被报道携带结构性破坏性TP53改变，联合处理下观察到的CDKN1A表达增加不应解释为经典野生型p53激活或p53依赖性机制的证据。转录组相互作用分析应与药理学HSA分析分开解释：对于大多数可进行相互作用检验的基因，未检测到对log2表达尺度上加性预期的统计学显著偏离，但这种无统计学显著性并不确立加性；一部分基因显示联合表达不同于单药效应之和。全局上，联合转录组以顺铂相关响应为主，同时保留JIB-04相关应激响应程序。因此RNA测序分析不支持广泛的转录协同，而是识别出治疗相关转录变化和选定的对加性预期的偏离，可能指导未来功能研究。顺铂处理和联合处理还与长基因的优先下调相关；顺铂诱导的DNA损伤可干扰RNA聚合酶II进程，使长转录本特别易受不完全转录影响。在本数据集中，顺铂抑制基因中许多表观神经元和突触Gene Ontology术语在长基因中富集，调整基因长度后其与顺铂处理的关联大幅降低，这反对将这些术语解释为UT-SCC-24A细胞中特定神经元转录程序的证据。72 h后qPCR分析显示选定凋亡和EMT相关转录本的治疗相关变化。顺铂增加CASP3、CASP9、BAX和BCL2 mRNA水平；联合处理下BAX mRNA表达与顺铂单药相似，而BCL2 mRNA表达较低，这些变化与Annexin V/PI测得的更大凋亡比例一致，但mRNA数据本身不能确立caspase激活、线粒体凋亡或BAX/BCL2平衡的因果作用。探索性免疫印迹提供了定性蛋白水平背景，顺铂单药后BCL2信号较强，联合处理下BCL2信号较低，而BAX信号在各处理条件间无清晰定性差异；这些观察与qPCR模式一致，但未确立内源性凋亡通路的激活。探索性光密度分析基于少量且可变的有效生物学重复，校正多重比较后BCL2或BAX相对对照未显示统计学显著差异。JIB-04已被报道可调节多种含JmjC结构域赖氨酸去甲基化酶的活性，并在癌症模型中影响增殖、DNA损伤响应和药物敏感性；然而，若无直接靶点结合实验，其在本模型中的效应不能归因于特定KDM的抑制。早期RNA测序数据集显示四种UT-SCC细胞系中多种含JmjC结构域KDM转录本的表达，存在细胞系间变异；这些数据证明基础转录表达，但未确立KDM蛋白丰度、酶活性或对JIB-04的响应性。探索性组蛋白免疫印迹分析显示联合处理下H3K36me3信号较强，H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3变化较不一致；探索性光密度分析中联合处理下H3K36me3信号约为对照的三倍，但校正多重比较后差异未达统计学显著性；由于对照中H3K27me3信号不可检测，无法与对照进行可靠的定量比较。这些发现与所检测的全局组蛋白标记的治疗相关变化相容，但未识别负责的KDM、未证明直接靶点结合或未确立组蛋白甲基化变化介导顺铂响应；因此观察到的效应应描述为与含JIB-04处理相关的药理学效应，而非已证实的KDM依赖性表观遗传重编程。转录分析也未确立EMT表型。顺铂增加VIM和TWIST1转录水平，JIB-04单独处理与CDH1、VIM和SNAI1表达的适度变化相关；联合处理下VIM和TWIST1仍升高。由于分析仅限于选定mRNA标志物，结果未在表型水平证明EMT诱导、逆转或维持，EMT相关发现应谨慎解释。24 h后RNA测序显示JIB-04处理后Hallmark EMT基因集正向富集，顺铂处理后负向富集，而联合处理下EMT基因集未显著富集；这些通路水平结果不意味着每个EMT相关基因的一致调控，例如联合组24 h时TWIST1和SNAI2增加。72 h后靶向qPCR分析显示顺铂暴露后VIM和TWIST1转录水平增加，联合处理下两者仍升高。RNA测序和qPCR结果之间的差异可能反映不同时间点、通路水平与靶向基因分析的差异以及长时间处理后存活细胞群体的变化。因此，本研究数据未确立EMT诱导、逆转或EMT相关转录变化对JIB-04和顺铂响应的因果贡献；需要蛋白水平分析和功能性迁移或侵袭实验来确定治疗是否影响上皮–间充质可塑性。UT-SCC系列间相互作用模式的变异性是本研究的重要结果。尽管UT-SCC-24A和UT-SCC-24B分别来源于同一患者的原发肿瘤和淋巴结转移灶，UT-SCC-24A中观察到的局部正向相互作用未在UT-SCC-24B或UT-SCC-42配对中以相同程度重现。这种异质性表明含JIB-04治疗的响应不能仅从肿瘤来源推断。潜在贡献因素包括药物转运、DNA损伤响应、细胞周期控制、凋亡启动、基础转录状态或染色质相关调控的变异，但这些因素未被直接检验，本研究数据未识别响应预测生物标志物。基础KDM转录数据同样未揭示能解释UT-SCC-24A响应的简单表达模式。研究存在若干局限性：第一，局部正向HSA相互作用仅在UT-SCC-24A中且在狭窄浓度区域内观察到，功能、分子和RNA测序分析因此仅限于单一模型，需要在独立HNSCC细胞系（包括无正向HSA相互作用的模型）中确认。第二，MTT评估细胞代谢活性，不直接测量活细胞数、克隆形成存活或长期治疗响应。第三，qPCR分析在72 h后进行，可能部分反映存活细胞群体；24 h RNA测序实验表征了早期转录响应，但仅在UT-SCC-24A中进行，不能确立因果关系。第四，研究未确定JIB-04的KDM靶点、未证明直接靶点结合或未确立组蛋白标记改变与联合响应之间的因果联系。功能、分子和RNA测序分析仅限于UT-SCC-24A细胞，限制了发现的普适性。此外，Western blot光密度分析为探索性：技术有效生物学重复数少且因蛋白和条件而异，单一有效重复的条件未进行统计分析，不可检测的H3K27me3对照信号妨碍了该标记与对照的定量比较。需要在独立HNSCC细胞系（包括无正向HSA相互作用的模型）中进一步验证，以确定观察到的响应在不同细胞和分子背景下是否一致。总体而言，这些结果支持在特定HNSCC细胞系模型中进一步开展JIB-04–顺铂联合方案的临床前研究。未来工作应包括在更多细胞系中进行系统剂量矩阵研究、直接测量活细胞数和克隆形成存活、响应与非响应模型的比较分析、组蛋白甲基化和凋亡标志物的定量验证以及KDM靶点结合的直接评估。
**结论翻译**：JIB-04在已建系HNSCC细胞系中以模型依赖性方式增强对顺铂的响应。在UT-SCC-24A中，于所测浓度矩阵的限定低剂量区域内识别出局部正向相互作用，联合处理较任一单药与更低的BrdU掺入、改变的细胞周期分布和更高的凋亡比例相关。早期RNA测序分析进一步显示，联合处理保留了JIB-04相关的综合应激响应特征以及顺铂相关的DNA损伤和细胞周期相关转录变化。总之，这些结果将UT-SCC-24A确定为JIB-04联合处理在限定浓度范围内与增强的顺铂细胞响应相关的模型。伴随的功能和转录发现为进一步研究与该响应相关的生物学背景提供了框架。由于相互作用在体外评估且在细胞系 panel 中并不一致，其可重复性和分子决定因素应在更多HNSCC模型中检验。
