巨大芽孢杆菌1259在已建立饮食诱导肥胖小鼠中限制肝脏脂质蓄积：配对肝脏转录组与代谢组分析

《Nutrients》：Bacillus megaterium 1259 Limits Hepatic Lipid Accumulation in Mice with Established Diet-Induced Obesity: Paired Hepatic Transcriptomic and Metabolomic Profiling

背景：肥胖促进异位脂质沉积和肝脏脂肪变性，后者是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的核心特征。由于微生物效应具有菌株和模型特异性，巨大芽孢杆菌1259（BM1259）是否影响已建立的饮食诱导肥胖尚不清楚。研究人员在持续高脂饮食（HFD）暴露期间评估了BM1259，并考察了伴随的肝脏变化。方法：雄性C57BL/6J小鼠先接受HFD喂养12周，随后分配至HFD+PBS组或HFD+BM1259组；正常饮食小鼠作为对照。BM1259（1×10¹⁰ CFU/鼠/天）在持续HFD喂养期间经灌胃给药8周。研究将表型、生化和组织病理学评估与肝脏RNA测序、非靶向代谢组学及配对多组学分析相结合。结果：干预终点时HFD+BM1259组体重显著降低。BM1259给药还与体重归一化的腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和肝脏重量降低、iWAT平均脂肪细胞面积减小、肝脏甘油三酯含量和油红O阳性面积降低相关。血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和空腹血糖较低，而腹腔葡萄糖耐量试验（ipGTT）曲线下面积（AUC）的降低未达统计学显著性。肝脏转录组差异涉及脂质摄取、合成、脂蛋白处理和脂肪酰基加工相关基因。代谢组差异包括胆碱-甘油磷脂、鞘脂、类固醇相关及酰基肉碱代谢相关特征。探索性配对分析提示基因表达与代谢物丰度之间可能存在关联。结论：在持续HFD暴露期间，BM1259与较低的肥胖相关及肝脏脂质负荷相关，值得作为候选微生物干预措施进一步研究。

研究背景方面，肥胖并非单纯的脂肪量增加，而是伴随脂肪组织功能的进行性改变。当脂肪组织储存能力受限时，脂肪细胞肥大和组织可扩展性受损促使脂质溢流至非脂肪器官，尤其是肝脏。肝脏脂肪变性是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的定义性特征，可自单纯性脂肪变进展为脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌，其全球负担随肥胖和2型糖尿病流行而上升。肝脏脂肪变性反映脂质获取、合成、氧化、储存和输出之间的失衡：脂肪酸经脂肪组织脂解和膳食来源进入肝脏，从头脂肪酶合成提供肝内贡献，处置主要依赖脂肪酸氧化和极低密度脂蛋白分泌。然而，甘油三酯储存量本身并不决定肝损伤，脂质组成、细胞内分布以及线粒体适应、氧化应激和炎症共同影响脂肪变性是否向脂毒性损伤进展。目前，特定微生物制剂正被作为代谢干预手段研究，但其效应不能视为一类共性：益生菌补充的荟萃分析显示体重和选定代谢结局的变化温和且异质，反应因菌株、剂量、人群和疗程而异；针对Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium longum的人体概念验证研究以及多种明确菌株在饮食诱导肥胖模型中的实验进一步表明，代谢反应既非跨菌株一致，也非跨结局一致。因此，菌株身份、宿主模型、疾病阶段和干预方案均是评估微生物候选物时必须考虑的因素。同一菌株特异性标准同样适用于产芽孢的芽孢杆菌属：益生菌的公认定义要求特定菌株在预期用途上具有已证明的健康益处，尽管芽孢杆菌芽孢可能具有实际稳定性和耐受胃肠道条件的优势，其安全性和生物活性仍需逐一确立。对部分巨大芽孢杆菌菌株的基因组和体外研究已鉴定出消化、抗菌、抗氧化或代谢特性，但这些观察不能确立可比的体内效应。BM1259最初分离自鸡粪，携带营养和氮代谢相关基因；在奶牛和荷斯坦公犊中的研究报告了瘤胃发酵、养分利用和生产相关指标的变化，且所检测的血液生化变量未见明显不良改变。但BM1259在肥胖建立后是否改变肥胖相关表型仍属未知。为此，研究人员在雄性C57BL/6J小鼠高脂喂养12周后给予BM1259，并在随后8周内维持膳食挑战，结合肥胖相关表型、肝脏病理以及配对肝脏转录组和非靶向代谢组分析，以刻画BM1259给药伴随的变化并为后续机制检验确定优先方向。

研究人员开展的研究为一项在已建立饮食诱导肥胖的雄性C57BL/6J小鼠中进行的8周干预实验。24只7周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠购自徐州医科大学实验动物中心，适应1周后分别给予正常饮食（ND，10%能量来自脂肪）或高脂饮食（HFD，60%能量来自脂肪），饲料均由协同生物（南京）提供。HFD喂养12周后，体重至少高于同龄ND小鼠平均体重20%者判定为饮食诱导肥胖；合格HFD小鼠按体重分层并随机分配至HFD+PBS组或HFD+BM1259组，同龄ND喂养小鼠构成ND+PBS组。每组初始8只以保证至少6只独立生物学重复可用于终点表型评估，全部8只均监测体重；终点评估前每组随机选取6只进行相应表型分析，两个HFD组中各随机选取4只进行配对RNA-seq和代谢组分析。在随后8周干预期间，小鼠维持既定饮食，HFD+BM1259组每日一次灌胃给予1×10¹⁰ CFU/鼠的BM1259，ND+PBS和HFD+PBS组给予等体积PBS；体重和摄食量每周固定时间测定两次，摄食量以笼为单位测定。干预第8周评估空腹血糖、腹腔葡萄糖耐量、血清生化指标、组织重量、肝脏甘油三酯含量和组织病理学。终点时经眶后静脉丛采血后以二氧化碳吸入处死，取肝脏和脂肪组织称重，样本或经4%多聚甲醛固定或液氮速冻后保存于?80 °C。所有程序经徐州医科大学动物伦理委员会批准（批准号202509T015）。

结论方面，在已建立饮食诱导肥胖的雄性C57BL/6J小鼠中，干预终点时HFD+BM1259组体重显著降低；BM1259给药还与脂肪组织负荷降低和肝脏脂质蓄积减少相关，后者由肝脏甘油三酯含量和油红O形态学计量共同支持；血清ALT、LDL-C和空腹血糖亦较低，而ipGTT AUC的降低未达统计学显著性，提示血糖反应是部分的。这些表型差异伴随某些肝脏脂质摄取和合成相关转录物表达水平降低，并在mRNA水平得到验证；此外观察到胆碱-甘油磷脂、类固醇和鞘脂代谢的改变。因此，BM1259值得作为候选微生物干预措施进一步研究。其重要意义在于：该研究采用肥胖建立后干预并持续高脂暴露的设计，回答的是已建立肥胖表型在持续营养压力下是否仍可被调节这一问题，而非BM1259能否预防肥胖发生；配对肝脏转录组与代谢组分析在同一肝脏样本中刻画了与给药伴随的分子变化，为后续机制研究确定了优先方向，同时研究明确了表型观察与分子关联的描述性性质，未推断因果机制。

关键技术方法方面，研究采用肥胖建立后干预的HFD小鼠模型（HFD喂养12周后以1×10¹⁰ CFU/鼠/天灌胃BM1259共8周，继续HFD喂养），样本来源为徐州医科大学实验动物中心提供的雄性C57BL/6J小鼠；表型评估包括ipGTT、血清生化、肝脏甘油三酯测定及H&E和油红O组织病理学定量；分子层面采用肝脏RNA测序（DNBSEQ-T7平台）结合生物信息学分析、RT-qPCR验证以及基于UHPLC-Orbitrap Exploris 120的非靶向代谢组学，并对同批配对肝脏样本进行转录组-代谢组联合分析。

研究结果方面，第一，BM1259与持续HFD喂养期间较低的脂肪和肝脏脂质负荷相关。HFD喂养12周后，合格饮食诱导肥胖小鼠被分配接受PBS或BM1259并继续HFD喂养8周；两组HFD小鼠分配时平均体重相近，随后平均轨迹分离，干预终点HFD+BM1259组体重显著降低；笼水平记录的摄食量在两组间呈大致相似的描述性轨迹。血糖反应较不一致：ipGTT中HFD+BM1259组测试后期（包括120 min）血糖较低，相应曲线下面积数值上低于HFD+PBS组但差异未达统计学显著性（p=0.073）；空腹血糖在BM1259给药后显著降低，但仍高于ND+PBS组，支持空腹血糖降低但不能 conclusive 地说明整体葡萄糖耐量改善。体重归一化的iWAT和肝脏重量在HFD+BM1259组显著低于HFD+PBS组；BM1259给药还与较低的血清ALT和LDL-C浓度相关；肝脏甘油三酯含量显著降低；代表性iWAT切片显示脂肪细胞肥大减轻，定量组织形态学证实平均脂肪细胞面积较小；肝脏H&E和油红O切片显示脂质蓄积范围较小，与显著降低的肝脏油红O阳性面积一致。体重归一化的附睾脂肪组织和血清总胆固醇、甘油三酯、HDL-C及AST在两组HFD小鼠间无显著差异。总体而言，表型反应在体重、脂肪组织负荷和肝脏脂质蓄积方面最为明显，肝脏表型由生化和组织学测量一致支持，而葡萄糖调节的改善是部分的。

第二，BM1259与肝脏脂质处理转录谱的协调变化相关。比较两组HFD小鼠肝脏转录组，主成分1和2分别解释总方差的39.30%和20.88%，样本按处理呈现部分分离，但组间重叠和组内变异仍然明显。差异表达分析鉴定出69个基因，其中HFD+BM1259组26个上调和43个下调（校正p<0.05）。聚焦热图显示所选脂质相关基因并非一致变化：与脂质摄取、脂蛋白转运、脂质合成或脂肪酰基处理相关的Cd36、Vldlr、Apoa4、Me1、Acot2和Dbi转录丰度在HFD+BM1259组较低，而与类固醇和甘油磷酸胆碱代谢相关的Cyp7b1和Gpcpd1转录丰度较高。RT-qPCR证实HFD+BM1259组肝脏Cd36和Me1 mRNA丰度较低，而Cyp7b1和Gpcpd1 mRNA丰度较高。KEGG富集分析鉴定出视黄醇代谢、谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对外源物代谢、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢和PPAR信号通路（校正p<0.05）；PPAR信号注释包括下调基因Cd36、Me1和Dbi；谷胱甘肽和外源物代谢相关基因主要包括Gsta和Gstm家族成员以及Mgst3、Gclc和Ugt1a9的转录丰度降低；归属类固醇和花生四烯酸代谢的细胞色素P450基因变化方向不一，富集结果反映通路成员间混合的转录变化而非通路的均匀激活或抑制。为确定协调的转录差异是否延伸至差异表达基因之外，研究使用完整排序肝脏转录组进行基因集富集分析（GSEA），与脂肪酸代谢、过氧化物酶体脂质代谢、脂肪酰基辅酶A生物合成、血浆脂蛋白重塑、甘油三酯代谢和甘油磷脂生物合成相关的Reactome基因集向HFD+PBS组富集（NES为?2.094至?1.627，校正p<0.05），提示这些脂质相关基因集在HFD+BM1259组中排序表达相对较低。

第三，BM1259与肝脏代谢谱及脂质相关通路的差异相关。非靶向代谢组学比较两组HFD小鼠肝脏代谢物谱，主成分1和2分别解释总方差的40.50%和17.20%，部分组间分离主要沿主成分1发生，混合质控样本紧密聚类支持数据集的分析重现性。以变量投影重要性（VIP）评分>1和双侧Student t检验p<0.05定义，鉴定出255个推定注释的候选差异代谢物，其中145个在HFD+BM1259组相对丰度较高、110个较低，13个候选物经Benjamini–Hochberg校正后仍显著。选取单独展示的6个代谢物代表代谢谱的若干组分：别孕烷醇酮和Oct-5-Enedioylcarnitine在HFD+BM1259组相对丰度较高，而甘油磷酸胆碱、1-硬脂酰-2-羟基-PC[LPC(18:0)]、二氢神经酰胺和鞘氨醇相对丰度较低（均p<0.01）；别孕烷醇酮、Oct-5-Enedioylcarnitine和甘油磷酸胆碱还保持FDR<0.05，LPC(18:0)、二氢神经酰胺和鞘氨醇经多重检验校正后未保持显著。这些候选物代表类固醇和酰基肉碱相关特征以及胆碱-甘油磷脂和鞘脂种类。候选差异代谢物中37个映射至KEGG通路，“Choline metabolism in cancer”（KEGG官方通路名称）和鞘脂信号通路经多重检验校正后仍显著富集（校正p<0.05）；核黄素代谢、辅因子生物合成、嘧啶代谢及维生素消化吸收亦达到校正显著性阈值；相比之下，甘油磷脂代谢、醚脂代谢和鞘脂代谢在未校正p<0.05时名义富集但校正后未保持显著。在此背景下，“Choline metabolism in cancer”指KEGG数据库中共有的胆碱和磷脂酰胆碱相关代谢节点，不提示癌症相关过程。

第四，探索性整合分析鉴定出潜在的肝脏基因-代谢物关联。研究在8个配对肝脏样本间计算Spearman相关系数以考察所选转录组和代谢组特征之间的共变，层次聚类产生两种大致相反的关联模式：Gpcpd1和Cyp7b1聚类在一起，与别孕烷醇酮呈正关联，但与若干胆碱-甘油磷脂和鞘脂代谢物呈反向关联；由Apoa4、Me1、Dbi、Cd36和Gclc组成的聚类总体呈相反模式。代表性相关包括Gclc与甘油磷酸胆碱（Spearman ρ=0.976）、Me1与LPC(18:0)（ρ=0.952）、Dbi与LPC(18:0)（ρ=0.905）以及Gpcpd1与别孕烷醇酮（ρ=0.881；均p<0.01）。然而，该分析包含49项比较且未进行多重检验校正，合并治疗组结构可能解释部分或全部表观共变，因此这些模式被视为描述性和假设生成性的，未将任何单个基因-代谢物对视为独立验证，也未推断组内关系。图5B呈现的是研究中观察到的组水平表型、转录水平和代谢物水平差异的描述性总结，而非经验证的机制通路。

讨论部分总结如下：最清晰的表型发现是，尽管持续HFD喂养，BM1259给药伴随较低的体重归一化iWAT和肝脏重量、较小的iWAT平均脂肪细胞面积、较低的肝脏甘油三酯含量和油红O阳性面积以及较低的循环LDL-C和ALT；生化肝脏甘油三酯测定与油红O形态学计量之间的一致性加强了较低肝脏脂质负荷的证据，但这些测量未能确定造成该差异的代谢过程。干预后期较低的体重轨迹在方向上与这些终点一致；两组HFD小鼠记录的平均摄食量呈相似模式，但每组仅两个笼的测量不能确立等效热量摄入，因此能量平衡改变对较低体重和肝脏脂质负荷的贡献仍未解决。肥胖相关肝损伤的发生不止于脂肪量过多：脂肪组织储存受损、脂肪细胞肥大、胰岛素抵抗以及炎症和内分泌紊乱可增加脂质向肝脏的输送并促进MASLD。因此本研究的表型观察构成较低的脂肪和肝脏负荷的一致模式；伴随的分子谱集中于肝脏脂质处理，脂质相关转录物和胆碱-甘油磷脂相关代谢物的变化在各自数据集中较为突出，鞘脂、类固醇相关、酰基肉碱和辅因子发现具有支持性但较不确定，其并行出现支持优先开展进一步研究，但不能确立功能耦合或共同因果通路。干预方案是解释这些发现的核心：BM1259仅在HFD喂养12周后引入，且膳食挑战在整个随后8周持续，因此实验询问的是已建立肥胖表型在持续营养压力下是否仍可被调节，而非BM1259能否预防肥胖发生。其他HFD小鼠模型中的明确细菌制剂（包括Lacticaseibacillus paracasei N1115、Lactiplantibacillus plantarum FRT4和HF02以及人源Faecalibacterium prausnitzii菌株）已显示降低肥胖、血脂异常或肝脏脂质蓄积，但这些发现提供的是背景而非可直接迁移至BM1259，因为微生物、剂量、饮食和干预方案不同，且微生物效应强烈依赖菌株和设置；同样，对B. megaterium MIT411的表征主要涉及与胃肠道用途相关的体外特性，未确立小鼠中的抗肥胖效应。因此当前数据特异于BM1259和这一肥胖后设计。数据还显示血糖反应有限：空腹血糖较低，但ipGTT AUC的降低未达统计学显著性；研究支持较低的空腹血糖，而非系统性葡萄糖耐量的明确改善。肝脏转录组为肝脏表型提供了分子背景：HFD+BM1259组中Cd36、Vldlr、Apoa4、Me1、Dbi和Acot2转录丰度较低，这些基因并非定义单一线性通路，而是代表脂质处理的多个方面，包括脂肪酸摄取、脂蛋白转运、NADPH供应和细胞内脂肪酰基加工。CD36因促进肝脏脂肪酸摄取并可促进SREBP1依赖性脂肪生成而相关，肝细胞特异性Cd36破坏可减轻HFD诱导的脂肪变性和胰岛素抵抗；ME1将苹果酸转化为丙酮酸同时生成用于脂肪酸和胆固醇合成的NADPH，ME1缺失与致肥胖喂养期间较低的肥胖和肝脏脂肪变性相关；较低的Vldlr、Apoa4、Dbi和Acot2转录丰度将这一模式延伸至脂蛋白和酰基处理。RT-qPCR再现了RNA-seq对Cd36、Me1、Cyp7b1和Gpcpd1差异的方向，为这些选定基因提供了转录水平佐证。全转录组GSEA通过显示与脂肪酸、过氧化物酶体脂质、脂肪酰基辅酶A、脂蛋白、甘油三酯和甘油磷脂代谢相关的若干Reactome基因集向HFD+PBS组富集，扩展了这些基因水平观察，支持肝脏脂质处理中存在协调的转录差异，但不表明BM1259对通路活性的一致抑制。总之，这些变化与当前肝脏脂质蓄积模型中描述的若干脂质获取和合成过程转录表征降低相一致。胆碱-甘油磷脂代谢提供了转录组和代谢组数据集之间最强的联系：肝脏Gpcpd1转录丰度较高，而甘油磷酸胆碱和LPC(18:0)较低；KEGG官方命名为“Choline metabolism in cancer”的通路经多重检验校正后仍显著，而甘油磷脂代谢仅名义富集且未达FDR阈值；在该数据集中，前者通路名称表示共有的胆碱和磷脂酰胆碱相关节点，不暗示癌症过程。Gpcpd1催化甘油磷酸胆碱水解为胆碱和甘油-3-磷酸，尽管该反应的代谢后果因组织和生理设置而异；该反应与肝脏脂质处理相关，因为磷脂酰胆碱及其溶血磷脂衍生物参与膜组织、脂滴表面和脂蛋白组装，实验性扰乱磷脂重塑也可改变肝脏LPC(18:0)丰度和饮食诱导的脂肪变性。此处观察到的组合支持甘油磷酸胆碱周转改变，但未显示Gpcpd1活性或通路通量增加；需要靶向磷脂测量和同位素示踪以区分磷脂酰胆碱合成、降解、再酰化和输出的变化，并确定这些过程是否促成肝脏表型。鞘脂结果描述了肝脏脂质重塑的第二个较未解决的组分：二氢神经酰胺和鞘氨醇在名义代谢物选择阈值下较低，但二者经FDR校正后均未保持显著，而鞘脂信号通路经多重检验校正后仍富集。神经酰胺及相关鞘脂参与胰岛素信号、线粒体功能、氧化应激、脂质储存和肝细胞损伤，但其生物学效应取决于分子种类、酰基链长度、细胞内定位和组织背景；实验性抑制二氢神经酰胺去饱和酶可改善肥胖小鼠的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性，而肝脏鞘磷脂合成酶1缺陷导致葡糖神经酰胺蓄积和进行性肝脏病理，这些对比结果说明为何两个注释代谢物的较低丰度不能等同于神经酰胺合成受抑或鞘脂毒性的一致降低；需要神经酰胺、二氢神经酰胺、鞘磷脂和糖鞘脂的靶向组合以确定哪些种类和合成途径发生了改变。类固醇相关、酰基肉碱和辅因子变化拓宽了代谢组反应但未提供单一解释机制：别孕烷醇酮升高伴随较高的Cyp7b1转录丰度，Cyp7b1参与氧固醇7α-羟化和替代性胆汁酸合成途径，而别孕烷醇酮是一种孕酮衍生的神经活性类固醇，经肝脏广泛代谢，其同时变化为检查类固醇和氧固醇相关代谢提供依据，但未确立直接的Cyp7b1-别孕烷醇酮关系；Oct-5-Enedioylcarnitine亦升高，酰基肉碱可反映底物进入、不完全脂肪酸氧化、过氧化物酶体或线粒体酰基处理或代谢物输出，其升高因此提示脂肪酸处理改变而非β-氧化增强；核黄素代谢和辅因子生物合成亦富集，核黄素缺乏可加重高脂喂养期间的肝脏脂质蓄积，但本研究中核黄素、FMN和FAD的相对 modest 差异不足以推断呼吸链活性增加，辅因子发现最好视为辅助性氧化还原信号，其依据是谷胱甘肽可用性和线粒体-内质网通讯可影响肝脏脂质蓄积和胰岛素抵抗的证据。配对设计允许在同8个肝脏样本内比较转录物和代谢物丰度：正的名义相关包括Gclc与甘油磷酸胆碱、Me1与LPC(18:0)和LPC(18:1)、Dbi与LPC(18:0)以及Gpcpd1与别孕烷醇酮；Gclc与FAD和Oct-5-Enedioylcarnitine呈负关联。这些关系符合脂质处理、磷脂代谢、类固醇相关代谢和氧化还原特征协调差异的更广泛模式，但不应被解释为直接调控、生化方向或底物-产物关系：49项展示的相关未进行多重检验校正，仅纳入8只动物且每组4只；所选特征源自差异分析和通路富集结果，且两个组学数据集均按处理部分分离，因此合并相关可能主要反映转录物和代谢物丰度的组间偏移；高的合并系数不能确立任一组内的关联或在考虑组别归属后仍存在的关联。RT-qPCR佐证了选定的转录水平差异，但未独立验证基因-代谢物相关。多组学整合可识别候选共变模式，但本分析未确立分子差异与表型结局之间的因果联系。本研究的优势在于肥胖后干预设计、BM1259给药期间持续HFD暴露以及同批肝脏样本的配对转录组和代谢组分析。应考虑若干局限：非靶向平台的代谢物注释需要靶向确认，转录组差异未在蛋白质、酶活性或代谢通量水平评估，因此将BM1259给药与肝脏反应联系起来的通路仍未解决；摄食量仅在每组两个笼中记录，限制了对能量摄入差异的评估，相似的笼水平均值不能确立等效热量摄入或排除摄入相关因素对观察到的表型差异的贡献；未测量能量消耗和粪便能量丢失，因此能量摄入、吸收和消耗对较低体重和肝脏脂质负荷的贡献仍未解决；BM1259的定植持久性、微生物群或肠道屏障变化以及细菌来源代谢物亦未评估，因此肝脏转录和代谢谱应解释为与细菌制剂给药相关的反应，而非明确肠道介导机制的证据；最后，使用单一饮食、剂量和干预时长下的雄性小鼠限制了发现的普适性。在这些边界内，BM1259作为该雄性肥胖后小鼠模型中的候选微生物干预措施值得进一步研究；其他实验设置中的疗效及其口服安全性仍有待确立。

研究结论部分翻译如下：在已建立饮食诱导肥胖的雄性C57BL/6J小鼠中，干预终点时HFD+BM1259组体重显著降低。BM1259给药还与脂肪组织负荷降低和肝脏脂质蓄积减少相关，后者由肝脏甘油三酯含量和油红O形态学计量支持。血清ALT、LDL-C和空腹血糖亦较低，而ipGTT AUC的降低未达统计学显著性，表明血糖反应是部分的。这些表型差异伴随某些与脂质摄取和合成相关的肝脏转录物表达水平降低，并在mRNA水平得到验证。此外，观察到胆碱-甘油磷脂、类固醇和鞘脂代谢的改变。因此，BM1259值得作为候选微生物干预措施进一步研究。