《International Journal of Molecular Sciences》：Schisandrin B Suppresses Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Through EGFR/AKT/mTOR Signaling and Mitochondrial Dysfunction
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胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度致死性肿瘤，因化疗耐药及治疗手段有限而预后不良。五味子乙素（Sch B）是来源于五味子（Schisandra chinensis）的生物活性化合物，已在多种恶性肿瘤中显示出抗癌作用，但其在PDAC中的作用尚不清楚。本研究采用网
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度致死性肿瘤，因化疗耐药及治疗手段有限而预后不良。五味子乙素（Sch B）是来源于五味子（Schisandra chinensis）的生物活性化合物，已在多种恶性肿瘤中显示出抗癌作用，但其在PDAC中的作用尚不清楚。本研究采用网络药理学、分子对接及体内外实验探讨Sch B的抗肿瘤机制，重点关注EGFR/AKT/mTOR信号通路与线粒体功能障碍。网络药理学鉴定EGFR、CASP3、BCL2和HSP90为Sch B的关键候选靶点，并采用分子对接和MD模拟探究其与这些蛋白的推测性相互作用。在PDAC细胞中，Sch B处理48 h可降低细胞活力。此外，Sch B抑制EGFR/AKT/mTOR信号传导并诱导线粒体功能障碍，特征表现为线粒体膜电位丧失、线粒体及胞质钙水平升高、ROS生成增加，并伴随凋亡信号激活。与吉西他滨联合处理显示出增强效应，可提升凋亡与氧化应激水平。此外，Sch B在PANC-1异种移植模型中显著降低肿瘤生长，并伴随肿瘤组织中EGFR、AKT、mTOR和HSP90蛋白表达下降。上述结果表明，Sch B发挥的抗肿瘤活性与调控EGFR/AKT/mTOR信号通路及线粒体功能障碍相关，支持将Sch B作为PDAC潜在治疗候选药物进一步研究，尤其是与标准化疗联合应用。
胰腺导管腺癌（PDAC）是5年生存率仅13%的高度致死性恶性肿瘤，其预后不良主要归因于晚期诊断、内在化疗耐药以及阻碍药物递送的致密促纤维增生微环境。吉西他滨（GEM）虽为PDAC治疗基石，但受限于耐药、全身毒性及在致密基质结构中递送不佳；FOLFIRINOX方案虽可延长生存，但毒性负担高，仅适用于部分可耐受患者。EGFR在PDAC中常过表达，可激活下游AKT/mTOR级联，促进细胞生长、增殖、存活与代谢适应，且公共数据集分析提示EGFR高表达与较差总生存相关。直接靶向EGFR的临床获益有限，主要归因于内在与获得性耐药机制，包括代偿性通路的反馈激活，因此多靶点治疗策略受到关注。网络药理学与分子动力学（MD）模拟等系统级计算策略可整合药物相关基因、疾病靶点与分子互作网络，有助于候选靶点与信号通路的识别与优选。五味子乙素（Sch B）是五味子的生物活性天然产物，具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理活性，既往报道其可增强结直肠癌细胞中帕尼单抗诱导的细胞毒性、抑制胃癌细胞生长、抑制肺腺癌细胞增殖、增强耐药卵巢癌细胞对多柔比星的敏感性、增强胃癌模型中5-氟尿嘧啶的疗效并抑制参与DNA损伤应答的ATR激酶活性，但其对EGFR/AKT/mTOR相关信号、线粒体功能障碍的影响及与吉西他滨在PDAC中的相互作用尚不充分。基于此，研究人员开展本研究，结果显示Sch B抑制PDAC细胞生长、诱导凋亡相关的线粒体改变，并在PANC-1异种移植模型中抑制肿瘤生长，且在体外增强吉西他滨相关应答，支持其作为PDAC治疗候选药物进一步研究。
研究人员开展本研究用到的主要关键技术方法包括：网络药理学靶点预测与蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络及MCODE聚类分析、GO与KEGG富集分析；分子对接与200 ns分子动力学（MD）模拟及MM-GBSA结合能量估算；PDAC细胞系MIA PaCa-2、PANC-1与非肿瘤HPNE细胞的MTT增殖、克隆形成、流式细胞术（细胞周期、Annexin V/PI凋亡、JC-1线粒体膜电位、Rhod-2线粒体钙、Fluo-4胞质钙、DCFH-DA ROS）检测及免疫印迹；siRNA沉默EGFR；Chou-Talalay联合指数分析；以及PANC-1细胞来源异种移植（CDX）BALB/c裸鼠模型（Sch B 20 mg/kg，吉西他滨25 mg/kg为阳性对照）与免疫组化（IHC）。
2.1 基于网络鉴定Sch B、吉西他滨与PDAC相关的候选靶点：通过多数据库检索Sch B（409个）、吉西他滨（1006个）靶点及PDAC相关靶点（4094个），去重后获得85个三者共同靶点并构建药物-靶点-疾病网络；基于STRING数据库构建含85个节点、837条边、平均节点度19.7的PPI网络，鉴定EGFR、CASP3、BCL2和HSP90AA1为核心共同靶点；MCODE算法识别4个功能簇，簇1得分最高（14.286），含EGFR、BCL2、CASP3、HSP90AA1等关键基因；GO与KEGG富集分析显示靶点主要涉及蛋白磷酸化、凋亡过程调控、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性及癌症相关通路、PI3K-Akt信号与凋亡等；构建的药物&疾病-靶点-通路网络进一步确认上述核心靶点与关键通路的中心地位。
2.2 Sch B与候选靶蛋白的分子对接与MD模拟：分子对接显示Sch B对EGFR、CASP3、HSP90、BCL-2的对接分数分别为?5.353、?4.128、?6.185、?4.267 kcal/mol，与参考抑制剂（厄洛替尼、Ac-DEVD-CHO、onalespib、S55746）相比呈现不同的预测相互作用模式，参考抑制剂对接分数总体更负，但该差异不应被解读为相对结合亲和力的直接度量；200 ns MD模拟显示Sch B与各靶点复合物的平均RMSD（EGFR 2.713 ?、HSP90 3.924 ?、BCL2 2.17 ?、CASP3 1.579 ?）与吉西他滨复合物相近，提示Sch B与这些分子靶点形成同等稳定的相互作用；RMSF分析显示主要残基波动局限于末端与环区；结合rGyr、SASA及MM-GBSA计算提供了结合相关能量的补充估计。
2.3 Sch B降低PDAC细胞活力并触发细胞周期阻滞：MTT实验显示Sch B对PDAC细胞活力呈剂量依赖性抑制，100 μM时MIA PaCa-2与PANC-1相对增殖降至54%与57%，IC50分别为145.1与115 μM，而对HPNE细胞至100 μM无细胞毒性；免疫印迹显示增殖标志物PCNA表达随Sch B处理逐渐降低；克隆形成实验显示100 μM Sch B使克隆形成分别减少82%与96%（p < 0.001）；流式细胞术显示Sub-G1群体显著升高（MIA PaCa-2由1.5%升至18.6%，PANC-1由3.7%升至20.4%，p < 0.001），提示进入凋亡。
2.4 Sch B诱导PDAC细胞凋亡并调控凋亡相关蛋白表达：Annexin V/PI染色显示Sch B显著提高凋亡细胞比例，100 μM时MIA PaCa-2晚期凋亡细胞升至41.4%（约为对照的46倍），PANC-1升至12.7%（约5倍）；免疫印迹显示BCL-2表达下调（MIA PaCa-2降至0.23倍，PANC-1降至0.54倍），cleaved caspase-3（升至1.78倍与1.71倍）与cleaved PARP（升至2.53倍与2.16倍）表达升高，提示Sch B通过线粒体介导的凋亡途径发挥作用。
2.5 Sch B破坏PDAC细胞线粒体膜电位（MMP）、钙稳态与氧化还原状态：JC-1染色显示Sch B剂量依赖性降低MMP，100 μM时MIA PaCa-2与PANC-1的MMP丧失分别达92.6%与42.8%；Rhod-2检测显示线粒体钙水平显著升高（分别升至60.9%与56.8%，p < 0.001）；Fluo-4检测显示胞质钙显著升高（MIA PaCa-2升高14.2倍，PANC-1升高2.4倍，p < 0.001）；DCFH-DA检测显示细胞内ROS生成显著增加，提示Sch B扰动线粒体功能与氧化还原稳态，最终驱动凋亡。
2.6 Sch B抑制PDAC细胞EGFR/AKT/mTOR信号通路：免疫印迹显示Sch B处理使p-EGFR水平在100 μM时降至MIA PaCa-2的0.57倍与PANC-1的0.12倍，p-mTOR降至0.48倍与0.59倍，p-AKT降至0.63倍与0.2倍；分子伴侣HSP90蛋白水平降至0.56倍与0.68倍，提示Sch B有效靶向并抑制EGFR/AKT/mTOR信号通路及HSP90下调，从而抑制PDAC细胞存活与增殖。
2.7 EGFR敲低增强Sch B诱导的PDAC细胞凋亡与线粒体功能障碍：Kaplan–Meier分析显示EGFR高表达患者总生存显著降低（风险比=1.6，p = 0.031），TNMplot分析显示EGFR在PDAC肿瘤组织（n = 248）中较正常组织（n = 108）显著上调（p = 2.15 × 10
?10）；siEGFR转染后EGFR mRNA降至0.57倍（MIA PaCa-2）与0.28倍（PANC-1），蛋白降至0.59倍与0.73倍；Annexin V/PI显示siEGFR联合Sch B的晚期凋亡进一步升高至54.6%与40.6%，高于单药；JC-1显示联合处理使MMP丧失进一步放大（JC-1绿色达46.2%与21.2%）；Rhod-2与Fluo-4显示线粒体钙（达48.3%与14.8%）与胞质钙（达34.8%与46.2%）显著升高；DCFH-DA显示ROS进一步增至45.0%与40.3%（均p < 0.001），提示EGFR敲低可增强Sch B诱导的凋亡、线粒体功能障碍、钙失调与氧化应激。
2.8 Sch B增强吉西他滨在PDAC细胞中的疗效：MTT联合处理显示Sch B（50或100 μM）与GEM（20或40 μM）共处理较单药显著降低细胞增殖；Chou-Talalay分析显示MIA PaCa-2所有受试组合的联合指数（CI）均小于1，PANC-1仅含40 μM GEM的组合CI小于1，提示协同作用取决于药物浓度与细胞系；共处理还增强晚期凋亡、MMP丧失、线粒体与胞质钙升高及ROS生成，提示Sch B通过促进凋亡、钙失调、线粒体功能障碍与氧化应激增强GEM的抗癌效应。
2.9 Sch B在PANC-1细胞来源异种移植（CDX）小鼠模型中显示强效抗肿瘤作用：皮下接种PANC-1细胞的BALB/c裸鼠给予Sch B（20 mg/kg）或吉西他滨（25 mg/kg，阳性对照）治疗，Sch B显著抑制肿瘤进展，肿瘤大小与肿瘤重量较对照显著降低，且在该实验条件下抑制作用较GEM组更明显；实验期间各组体重无明显变化；肿瘤组织免疫印迹与IHC证实Sch B处理后EGFR、mTOR、AKT与HSP90表达显著降低，与体外结果一致。
讨论部分指出，PDAC预后差源于晚期诊断、化疗耐药与致密促纤维增生微环境，天然产物是抗癌药物开发的重要来源。Sch B在肺癌、胶质瘤、鼻咽癌等恶性肿瘤中的抗癌作用与本研究在PDAC中观察到的PCNA降低、Sub-G1升高与克隆形成抑制一致；本研究所用20 mg/kg剂量依据既往研究选定，该模型中Sch B组肿瘤生长抑制较GEM组更明显。体内实验主要评价Sch B单药疗效、GEM作为阳性对照，而非评估联合疗效，故Sch B与GEM的联合效果尚待体内验证；体重无显著变化并不能排除潜在全身毒性，需进一步开展血液学、生化与组织病理学评估；皮下异种移植模型不能完全再现胰腺肿瘤微环境，尤其基质结构与肿瘤-宿主相互作用，需采用原位PDAC模型进一步验证。网络药理学为复杂疾病多靶点药物发现提供了新范式，本研究鉴定EGFR、CASP3、BCL2、HSP90为候选靶点；从结构角度，EGFR含胞内ATP结合激酶结构域，HSP90含N端ATP结合口袋，BCL-2含疏水BH3结合槽，CASP3为执行型半胱氨酸蛋白酶；Sch B有效下调EGFR/AKT/mTOR信号并下调稳定致癌蛋白的分子伴侣HSP90；分子对接与MD模拟仅提供预测性结合姿态与结构动力学信息，HSP90复合物中较明显的RMSD波动可能反映其N端结构域固有的构象柔性，蛋白Cα RMSD主要反映构象变化，不能独立确定配体结合稳定性或解离；这些计算结果表明相关蛋白应被视为需进一步研究的候选靶点，而非实验验证的直接分子靶点；对接分数与RMSD/RMSF不能直接用于确定可靠的解离常数（Kd）。线粒体功能障碍是癌细胞凋亡的标志与PDAC有前景的治疗靶点，Sch B诱导线粒体膜电位剂量依赖性降低、线粒体与胞质钙升高及ROS增加，并下调抗凋亡蛋白BCL-2、升高cleaved PARP与cleaved caspase-3，支持其通过线粒体途径诱导凋亡；EGFR敲低增强Sch B诱导的线粒体功能障碍、钙失调与氧化应激，提示EGFR信号可能调节线粒体对Sch B的应答，Sch B至少部分通过调控EGFR/AKT/mTOR信号通路靶向线粒体功能障碍。联合治疗是提高PDAC疗效的重要策略，与既往报道的其他天然产物联合GEM的作用机制相比，本研究Chou-Talalay分析显示Sch B与GEM的协同作用呈浓度与细胞系依赖性，共处理增强凋亡、线粒体功能障碍、钙失调与ROS产生，但这些终点未正式进行协同性评价；本研究选择GEM而非FOLFIRINOX，直接比较超出本研究范围，值得进一步研究。
研究结论部分译为：总之，本研究构建了综合性计算与实验框架，证明Sch B对PDAC发挥强效抗癌活性。通过系统级网络药理学方法鉴定EGFR、CASP3、BCL2和HSP90为关键分子靶点，并经分子对接与MD模拟验证，揭示稳定的结合相互作用。体外分析证实Sch B抑制EGFR/AKT/mTOR信号通路，并通过破坏膜电位、钙稳态与氧化还原平衡诱导线粒体介导的凋亡。值得注意的是，EGFR敲低进一步放大上述效应，凸显EGFR在线粒体完整性中的调控作用。Sch B在体外与吉西他滨表现出协同疗效，增强凋亡与氧化应激。此外，Sch B在异种移植小鼠模型中显著减小肿瘤生长，进一步佐证其治疗潜力。总体而言，本整合性研究凸显Sch B作为一种有前景的多靶点药物，借助基于网络的靶点鉴定与动力学模拟验证，有望克服PDAC治疗的现有局限。本研究亦存在若干局限：所提出的分子靶点尚需直接实验验证，体外所用浓度的临床相关性仍不确定；此外，缺乏体内联合治疗实验、毒性评估有限以及采用皮下异种移植模型，均需进一步研究以确立Sch B在PDAC中的治疗潜力。尽管如此，本研究结果支持将Sch B作为单药或联合治疗候选药物在临床肿瘤学中进一步转化开发。
