《Journal of Fungi》：Inhibitory Effects of Benzyl Isothiocyanate on the Development and Pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides
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由胶孢炭疽菌（*Colletotrichum gloeosporioides*）引起的炭疽病是一种具有破坏性的采后病害，会显著降低苹果果实的品质和货架期。目前，有效且环境友好的该病害防控策略仍然有限。本研究探究了苯并异硫氰酸酯（benzyl isothiocy
由胶孢炭疽菌（*Colletotrichum gloeosporioides*）引起的炭疽病是一种具有破坏性的采后病害，会显著降低苹果果实的品质和货架期。目前，有效且环境友好的该病害防控策略仍然有限。本研究探究了苯并异硫氰酸酯（benzyl isothiocyanate，BITC）——一种天然存在的含硫挥发性有机化合物——对*C. gloeosporioides*的抗真菌活性，并阐明了其潜在作用机制。体外（in vitro）试验表明，BITC强烈抑制真菌生长和发育，在25 mg/L时菌丝生长被完全抑制，在30 mg/L时孢子萌发及芽管伸长被完全抑制。体内（in vivo）试验中，150 mg/L的BITC有效抑制了苹果果实上炭疽病病斑的扩展。进一步的机制分析表明，BITC诱导了膜脂过氧化，破坏了膜完整性，并导致细胞内含物泄漏，从而显著降低了孢子活力。此外，逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析显示，BITC显著下调了多个关键致病性相关基因的表达。综上，这些发现表明BITC通过破坏膜完整性和抑制致病性来抑制*C. gloeosporioides*，突显了其作为天然抗真菌剂用于采后苹果炭疽病管理的潜力。
**研究背景与意义**
采后真菌病害对全球水果生产和贸易构成严重威胁，每年在贮藏、运输和销售环节造成大量经济损失。在众多采后病害中，由炭疽菌属（*Colletotrichum* spp.）引起的炭疽病对热带和温带水果造成严重危害，该属真菌被列为全球最具经济重要性的植物病原真菌之一。对于苹果（*Malus domestica*）而言，采后炭疽病主要由半活体营养型真菌胶孢炭疽菌（*C. gloeosporioides*）引起，表现为特征性的凹陷病斑和组织的快速腐烂，严重影响果实品质和货架期。目前，病害防控主要依赖合成杀菌剂，但长期过量施用已导致抗药性菌株的出现，同时引发果实化学残留和环境污染等问题。这些弊端促使研究人员探索有效、安全且环境友好的替代方案，多种植物源化合物——包括精油、酚类物质和挥发性代谢产物——已显示出对采后水果病原菌的强效抗真菌活性。苯并异硫氰酸酯（BITC）是十字花科植物中硫代葡萄糖苷的主要水解产物，在医学应用中已展现出良好的生物活性，尤其在癌症治疗领域。鉴于其化学特性以及通过膜损伤和氧化应激等机制破坏真菌基本生理过程的能力，BITC作为植物源杀菌剂具有巨大潜力。异硫氰酸酯类化合物因其多靶点作用模式、适合气相应用的挥发性以及较短的环境持效期，作为可持续杀菌剂替代品日益受到关注。前期研究已证实BITC对多种采后病原菌具有抗真菌活性，包括番茄果实上的链格孢（*Alternaria alternata*）和草莓果实上的灰葡萄孢（*Botrytis cinerea*）。然而，BITC对*C. gloeosporioides*的抗真菌效果尚不清楚，其潜在作用的生理和分子机制也未被系统表征。这一知识空白制约了BITC作为防控水果炭疽病实用方案的开发。因此，本研究旨在：（i）从菌丝生长和孢子萌发方面评价BITC对*C. gloeosporioides*的体外抗真菌活性；（ii）评估其在体内控制苹果果实炭疽病发展的效果；（iii）通过膜完整性和氧化损伤的生理分析结合分子水平研究，阐明其潜在机制。
**关键技术方法概述**
研究人员采用体外毒力平板法测定BITC对菌丝生长的抑制作用，采用液体培养法评估对孢子萌发和芽管伸长的影响；以苹果果实为材料进行体内防效试验；采用荧光素二乙酸酯（FDA）染色结合荧光显微镜检测细胞活力；通过电导率仪测定相对电导率，硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量，以及测定核酸、可溶性蛋白和可溶性糖泄漏量评估膜完整性；采用RT-qPCR技术定量分析致病性相关基因的转录水平。供试菌株分离自病害芒果果实，苹果果实购自厦门当地超市。
**研究结果**
**BITC抑制*C. gloeosporioides*菌丝生长**
通过毒力平板法测定不同浓度BITC对菌落扩展的影响，结果表明，与对照相比，即使在低浓度（10和15 mg/L）下BITC仍显著减少菌落扩展，且呈浓度依赖性。在25 mg/L时，菌丝生长被完全抑制，实验期间无可见菌落形成，证明BITC对*C. gloeosporioides*具有强效抗真菌活性。
**BITC抑制*C. gloeosporioides*孢子萌发和芽管伸长**
通过液体培养结合光学显微镜观察，结果显示BITC对孢子萌发和芽管伸长均具有抑制作用。对照组孢子在9 h内萌发率接近100%，而随BITC浓度升高萌发率逐渐降低；在20 mg/L时仅约20%孢子萌发，30 mg/L时萌发完全被抑制。芽管伸长呈现类似的浓度依赖性模式，9 h时未处理孢子的芽管伸长至近100 μm，而所有BITC处理均显著限制其伸长。表明BITC通过联合抑制孢子萌发和芽管伸长损害侵染结构的形成。
**BITC减轻苹果炭疽病**
通过苹果果实接种试验，结果显示BITC显著抑制病斑发展。对照果实接种后2天出现症状且病斑迅速扩展，而BITC处理显著减小病斑直径。接种后6天，对照病斑直径约达30 mm，50和100 mg/L BITC处理果实病斑分别限于20 mm和10 mm以下。值得注意的是，150 mg/L BITC在整个观察期内完全阻止了病斑扩展，表明BITC对控制苹果采后炭疽病具有强大潜力。
**BITC处理损害*C. gloeosporioides*细胞活力**
通过FDA染色结合荧光显微镜检测，结果表明BITC处理显著损害分生孢子活力。孵育2 h后，约80%对照分生孢子呈现强烈绿色荧光，表明酯酶活性高、活力强。相比之下，20 mg/L BITC处理组荧光分生孢子比例降至约45%，而30 mg/L时仅见少量绿色荧光分生孢子，表明细胞活力近乎完全丧失。
**BITC处理影响*C. gloeosporioides*电导率和MDA产生**
通过电导率测定和MDA含量检测，结果表明BITC处理细胞的相对电导率在暴露初期快速上升并在整个孵育期持续升高，30 mg/L时升高最为明显，而对照组在整个8 h孵育期内电导率维持在低水平，证明BITC有效破坏细胞膜屏障导致大量电解质泄漏。MDA水平在BITC处理细胞中呈时间依赖性增加，30 mg/L时积累最显著，而对照组MDA含量基本不变。证实BITC触发*C. gloeosporioides*细胞膜的脂质过氧化，损害其结构和功能完整性。
**BITC处理诱导*C. gloeosporioides*细胞泄漏**
通过测定核酸、可溶性蛋白和可溶性糖的泄漏量，结果显示BITC处理细胞的核酸泄漏在整个8 h孵育期内持续高于对照，呈浓度依赖性增加，30 mg/L时最高。可溶性蛋白泄漏在处理早期即显著增加，可溶性糖泄漏同样呈浓度依赖性模式。表明BITC尤其在高浓度下严重破坏*C. gloeosporioides*的膜完整性，导致细胞质成分大量外泄。
**BITC处理抑制*C. gloeosporioides*致病性相关基因的表达**
通过RT-qPCR定量分析6个致病性相关基因（*CgSLT2*、*CgSCD*、*CgPKS*、*CgPG*、*CgHSF1*和*Cgl-SET5*）的转录水平，结果显示20和30 mg/L BITC处理显著抑制了所有6个基因的转录丰度。其中*CgPKS*和*CgPG*的抑制尤为显著，30 mg/L时其表达水平分别降至对照值的24%和22%，而*CgSLT2*和*CgHSF1*转录本降低约40%。表明BITC有效抑制了致病所必需基因的转录。
**讨论与结论**
讨论部分指出，*C. gloeosporioides*感染宿主过程中经历一系列连续的发育转变：分生孢子首先附着于宿主表面，随后萌发产生芽管并分化为黑色素化的附着胞，通过膨压穿透植物角质层，之后初生菌丝出现并定殖宿主组织，最终形成坏死病斑。感染循环的每一步均为完整致病性所必需，干扰任一阶段均足以遏制炭疽病发展。BITC在体外对*C. gloeosporioides*表现出强效活性，呈浓度依赖性抑制菌丝生长、分生孢子萌发和芽管伸长，表明BITC破坏了病原菌发育和侵染起始所必需的多个生物学过程。值得注意的是，*C. gloeosporioides*孢子萌发完全抑制浓度（30 mg/L）低于已报道的*B. cinerea*（50 mg/L），提示*C. gloeosporioides*对BITC高度敏感。在体内，BITC同样显著限制苹果果实上炭疽病病斑扩展，150 mg/L时实现完全抑制。在膜损伤方面，BITC处理显著增加细胞MDA含量（脂质过氧化的标志），表明膜脂氧化损伤和膜完整性受损；电导率显著升高反映膜通透性增加；膜破坏导致细胞内含物（核酸、可溶性蛋白和可溶性碳水化合物）泄漏，扰乱代谢稳态，最终导致细胞死亡和致病潜力减弱。FDA染色结果进一步证实BITC直接损害细胞活力。在分子层面，BITC浓度依赖性下调了调控不同侵染过程的关键致病性相关基因：MAP激酶*CgSLT2*（调控产孢、极性生长、附着胞形成和致病性）、*CgSCD*和*CgHSF1*（调控黑色素生物合成和附着胞形成）、聚酮合酶*CgPKS*（参与DHN-黑色素生物合成）、*CgPG*（介导宿主细胞壁果胶降解）以及组蛋白H4甲基转移酶*Cgl-SET5*（维持细胞壁完整性和过氧化物酶体生物发生），表明BITC在转录水平抑制*C. gloeosporioides*的致病性。尽管BITC的天然来源和挥发性使其适用于采后熏蒸或活性包装，但实际应用仍受限于其不稳定性、高剂量下潜在感官影响以及缺乏优化制剂。未来研究应聚焦控释制剂、与气调包装的整合以及感官评价。
结论部分翻译如下：综上，本研究鉴定BITC为一种有效控制由*C. gloeosporioides*引起的苹果采后炭疽病的强效抗真菌剂。BITC表现出多方面的抗真菌活性，在体外强烈抑制菌丝生长和分生孢子萌发，在体内显著抑制苹果果实上的病害发展。其杀菌活性主要通过脂质过氧化诱导的质膜完整性破坏介导，导致细胞内含物大量泄漏并最终降低细胞活力。同时，BITC通过下调宿主侵染所需基因来减弱病原菌毒力。对生理功能和分子调控的协同破坏构成了BITC强效且多方面的抗真菌活性基础。综上，这些发现为开发BITC作为有前景的植物源杀菌剂用于采后水果病害的可持续管理奠定了科学基础。
