《Cancer Treatment and Research Communications》：Epigenetic Profiling of Neuroactive Curcumin on Histone Signatures in Breast Cancer using gen3DNet
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姜黄素（curcumin）作为一种神经活性化合物，已在计算机模拟（in silico）中被鉴定为乳腺癌的候选药物，尚待体内（in vivo）验证。姜黄素相关的表观遗传改变提示乳腺癌中候选的化疗诱导的周围神经病变（CIPN）信号通路。三维（3D）网络模型能够生成
姜黄素（curcumin）作为一种神经活性化合物，已在计算机模拟（in silico）中被鉴定为乳腺癌的候选药物，尚待体内（in vivo）验证。姜黄素相关的表观遗传改变提示乳腺癌中候选的化疗诱导的周围神经病变（CIPN）信号通路。三维（3D）网络模型能够生成组蛋白翻译后修饰（PTMs）、磷酸化蛋白质与姜黄素之间详细的相互作用组（interactome）。针对组蛋白PTMs和磷酸化蛋白质的研究为癌症治疗提供了潜在的候选治疗靶点。
乳腺癌目前是全球发病率最高的癌症，每年新发病例约230万例。其发生与进展由遗传、表观遗传及环境因素的复杂交互作用所决定。尽管BRCA1和BRCA2等基因突变在乳腺癌病因学研究中长期受到重视，但越来越多证据表明表观遗传改变在细胞由正常状态向癌性状态转变中发挥重要作用。这些表观遗传异常可改变肿瘤相关基因的表达，并破坏细胞分化、存活、迁移和侵袭等关键通路。与基因突变不同，表观遗传异常具有可逆性，因而被视为癌症治疗开发的潜在生物标志物候选。然而，这些表观遗传改变的身份及其因果机制在很大程度上仍不清楚。本研究聚焦的表观遗传标志为组蛋白蛋白质上的翻译后修饰（PTMs），组蛋白是构成染色质的结构基础单元之一。这些PTMs包括组蛋白N端尾部四类不同的共价修饰：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。依据这些PTMs的类型、数量和位置所构成的“组蛋白密码”，它们可对染色质结构和基因调控产生不同影响。例如，H3K4me3促进开放染色质状态从而促进基因转录；而H3K27me3则为抑制性标志，提示闭合染色质状态。这些组蛋白PTMs由被称为“阅读器”“书写器”和“擦除器”的专一性酶所调控，通常是药物暴露等环境刺激后蛋白质信号事件的终点。参与这些信号网络的磷酸化蛋白质也可作为表观遗传药物疗法的候选生物标志物。在众多研究其表观遗传活性的物质中，姜黄素是一种具有多效生物学效应的天然生物活性化合物，来源于香料姜黄，数百年来用于传统亚洲烹饪和医药，据报道具有抗炎、抗氧化、神经保护和抗癌等多种药理特性。姜黄素已被证明可通过调控多种细胞信号通路抑制乳腺癌，包括细胞增殖、凋亡、细胞周期阻滞、活性氧应激（ROS）和微小RNA，其分子靶点涵盖NF-κB、cyclinD1、P13K、Raf-1、NRF2和p53等。除这些机制外，姜黄素还被发现可影响组蛋白修饰，调节癌细胞系中的组蛋白乙酰化和甲基化。例如，在一项三阴性乳腺癌（TNBC）研究中，姜黄素通过降低抑癌基因DLC1启动子处的H3K27me3来抑制致癌性EZH2，从而诱导肿瘤细胞凋亡。然而，仍需更多研究确定姜黄素对特定组蛋白的影响及其表观遗传调控背后的信号机制。姜黄素的神经保护作用可能在乳腺癌治疗中作为当前化疗的辅助手段发挥额外重要作用。化疗诱导的周围神经病变（CIPN）是抗肿瘤药物给药中最常见的副作用和主要限制之一。奥沙利铂等化疗药物无差别地靶向包括神经元和胶质细胞在内的健康细胞，导致细胞损伤并引发神经病变。CIPN症状可从急性、短暂的感觉异常到化疗停止后仍持续的慢性疼痛不等。初步证据将神经病理性疼痛的调控与组蛋白修饰（如组蛋白乙酰化和去乙酰化）的变化联系起来，但确切效应和机制仍需进一步研究。姜黄素已被证明可通过抗氧化、抗炎和表观遗传机制（如抑制促痛觉分子上的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性）对抗神经毒性并缓解神经病理性疼痛。多项关于姜黄素作为奥沙利铂治疗辅助剂的研究显示，其在不降低铂类药物抗癌潜力的前提下可有效防止其不良反应。然而，关于姜黄素减轻神经病变背后的表观遗传靶点和分子机制仍需更多信息。本文旨在通过应用基于机器学习的3D网络模型整合和分析跨多个细胞系的多组学数据，阐明姜黄素对乳腺癌组蛋白标志调控的神经活性效应。随后利用这些标志假设姜黄素发挥抗癌和神经保护效应所利用的潜在信号通路。这些数据作为美国国立卫生研究院基于网络的细胞特征整合库（LINCS）计划的一部分被汇编，该计划旨在系统编目细胞对一系列化学、遗传和疾病扰动剂的反应；姜黄素被列入其具有神经活性特性的化合物清单。利用名为gen3DNet的三维（3D）数据连接网络模型，研究人员旨在描绘封装姜黄素在乳腺癌中药物反应的组蛋白标志以及构成其分子关联的相关磷酸化信号蛋白。gen3DNet是iPhDNet的优化和泛化版本，后者此前已被确立为通过跨多个细胞系的组蛋白标志分析预测乳腺癌治疗疗效的有效计算框架。本研究将：1）鉴定跨多个细胞系的组蛋白密码功能模块；2）推断哪些磷酸化蛋白质在乳腺癌中贡献于这些组蛋白功能模块；3）将这些乳腺癌标志与神经病变相关的背根神经节（DRG）基因联系起来，以假设姜黄素介导的潜在信号通路。利用这种数据驱动方法，研究人员希望假设姜黄素的表观遗传关联，以便通过体内验证进一步研究，从而获得机制见解及其作为神经活性化合物在乳腺癌药物治疗中的潜在疗效。
研究人员开展的研究为对公共多组学数据进行二次分析。数据来自LINCS PCCSE Panorama Repository，包含五种癌细胞系（MCF7乳腺、PC3前列腺、A375皮肤、A549肺、YAPC胰腺）及两种神经细胞谱系（神经祖细胞NPC和星形胶质细胞），各细胞系经包括姜黄素（1 μM）在内的31种神经活性药物扰动，每种药物设三个生物学重复，以二甲基亚砜（DMSO）为阴性对照。通过基于质谱的蛋白质组学检测测量磷酸化蛋白质（P100，处理后3小时采集）和全局染色质谱（GCP，处理后24小时采集）。此外获取MCF7细胞系经姜黄素（1.11 μM）处理6和24小时的L1000 RNA转录组数据。另从GEO获取奥沙利铂处理小鼠背根神经节（DRG）的公开差异表达基因列表（GSE286387）用于二次分析。研究应用gen3DNet（v1.0.0）生成姜黄素-磷酸化蛋白质-组蛋白之间的3D网络相互作用，该工具由非负矩阵分解（NMF）和偏最小二乘回归（PLSR，含10折交叉验证）两部分组成。NMF用于鉴定组蛋白标志，PLSR用于构建组蛋白-肽段相互作用网络，并对PLSR系数进行方差分析（ANOVA，校正p值<0.01）以确定统计学显著的磷酸化蛋白质。最终利用Cytoscape可视化整合的药物-磷酸化蛋白质-组蛋白3D网络。
研究结果如下：
两个跨不同癌症和神经细胞系鉴定的功能组蛋白模块：研究人员利用NMF鉴定出与五种癌症和两种神经细胞系相关的两个功能模块。第一个模块由30个独特组蛋白密码组成，包含MCF7（乳腺癌）、PC3（前列腺癌）、NPC和星形胶质细胞；第二个模块由19个组蛋白密码组成，包含YAPC、A375和A549。MCF7与PC3聚类在一起提示激素失调相关癌症中姜黄素对表观遗传景观影响的相似性；MCF7与NPC和星形胶质细胞聚为一类则提示姜黄素在乳腺癌和神经病理学中可能具有相关的表观遗传关联。
姜黄素在乳腺癌中介导的磷酸化蛋白质-组蛋白关联：研究人员将gen3DNet的NMF模块应用于MCF7的GCP数据集，将组蛋白密码和神经活性药物聚类为三个不同标志，姜黄素被分配到第二个聚类，连同两个特定组蛋白密码H3K79me1和H3K56me0。随后应用PLSR模块预测磷酸化蛋白质-组蛋白关联。经统计学显著性过滤（p值<0.01）后，得到39个不同磷酸化蛋白质与两个组蛋白密码之间的40个独特关联，并可视化为连接姜黄素-磷酸化蛋白质-组蛋白的3D网络。网络中前11个富集磷酸化蛋白质（具有最高PLSR系数且p值<0.01）为ZC3H14、NUP214、RBM17、TMSB4X、SYNRG、EIF4A3、PFKP、PRRC2、CCNYL1、RPS6KA3和TMPO。
与乳腺癌中姜黄素相关的两个组蛋白修饰：文献检索显示，gen3DNet分析发现的与姜黄素显著连接的组蛋白PTMs为H3K56me0和H3K79me1，两者在本研究中均呈升高。H3K56me0是一种生物学功能数据有限的新标志，“me0”特指H3K56位点缺乏甲基化，其本身可能具有功能相关性。既往研究将H3K56me1表征为DNA复制的重要促进因子，作为核机器的重要停靠位点，提示H3K56me0中K56甲基化的缺失可能导致细胞周期紊乱，从而支持姜黄素在乳腺癌细胞中诱导细胞周期阻滞以抑制肿瘤生长的可能性。第二个标志H3K79me1与其对应物H3K79me2/3一样与转录激活相关。有研究报道H3K79从单甲基化向二甲基化和三甲基化的转变与基因转录活性由低到高相关。虽无研究直接将H3K79me1与乳腺癌联系，但有证据表明H3K79me2与乳腺癌基因表达正相关；此外，通过靶向唯一已知的H3K79甲基转移酶DOT1L抑制H3K79甲基化可抑制乳腺癌增殖。尽管本研究中H3K79me1升高，但单甲基化在细胞调控中的作用和/或其基因组位置可能与H3K79me2不同，仍可能有助于乳腺癌抑制，需功能实验确认。此外，H3K79甲基化和DOT1L活性对神经功能也很重要，H3K79甲基化对神经元发育和调控是必需的，DOT1L有助于维持正常的皮层和小脑发育，提示H3K79甲基化可能是姜黄素作为神经活性药物发挥作用的细胞机制中的表观遗传候选。
与组蛋白PTMs相关的富集磷酸化蛋白质的功能分析及与神经基因列表的比较：研究人员整合了MCF7细胞系经姜黄素扰动的L1000基因表达数据。在PLSR鉴定为显著的39个独特磷酸化蛋白质中，23个匹配L1000检测捕获的基因。比较L1000 CD系数方向与P100方向，6小时时23个基因中有15个匹配，24小时时仅6个匹配（其中4个基因在所有时间点均匹配）。文献将多个富集磷酸化蛋白质与癌症联系起来：例如RBM17在多种癌症中过表达并与耐药和生存期缩短相关；TMPO在包括乳腺癌在内的多种癌细胞系中上调；两者在P100数据中均降低，与姜黄素潜在抗癌活性相对应。而RPS6KA3（即RSK2）高表达在乳腺癌患者中显示更有利的生存，在本研究中升高。Metascape鉴定出的最富集生物学过程包括细胞骨架组织调控、轴突导向、RNA剪接和细胞周期。研究人员进一步研究与神经细胞系和神经病变相关基因的重叠：MCF7、NPC和星形胶质细胞三种细胞系共同重合的五个基因为LIMA1、RPL12、UBE2O、SH3KBP1和TMPO。与奥沙利铂处理小鼠DRG差异表达基因列表交叉参照，在271个显著DRG基因（倍数变化>1.5）中，TMPO磷酸化蛋白质具有统计学显著性（FDR<0.05）。
蛋白质-蛋白质相互作用和转录因子分析揭示潜在信号通路：研究人员使用Enrichr鉴定相关转录因子，基于概率评分和在乳腺癌中的生物学意义选择五个转录因子：YY1、ZBTB7A、EGR1、KAT2A和STAT3。随后使用STRINGdb预测这些转录因子与23个富集磷酸化蛋白质（作为可能的TF靶标）之间的相互作用。在提出潜在信号通路时，研究人员聚焦于连接TFs与gen3DNet网络分析中 top 富集磷酸化蛋白质的关系。一个潜在信号通路示例涉及转录因子ZBTB7A下游影响磷酸化蛋白质PFKP和TMPO。观察该通路中每个基因在三个时间点的表达：PFKP在姜黄素暴露后所有可用时间点均升高，而TMPO和ZBTB7A最初降低；然而ZBTB7A和TMPO在24小时均从下调转为上调，暗示姜黄素的影响可能在首次暴露后24小时内减弱。研究人员还表征了PPI分析中的其他潜在通路，包括涉及STAT3与PFKP和TMPO的类似信号通路，但由于STAT3上调已知促进乳腺癌恶性，其在本研究中升高使其与姜黄素的抗肿瘤潜力更为模糊。另一可能通路连接转录因子EGR1、核孔蛋白NUP214和RNA解旋酶EIF4A3，EGR1在L1000数据中上调与乳腺癌抑制相对应，EIF4A3在本研究中升高，但抑制EIF4A3才被证明可抑制乳腺癌增殖和转移。基于这些评估，研究人员假设ZBTB7A和TMPO的信号通路是姜黄素在乳腺癌中表观遗传调控最相关和最可能的通路。
讨论部分总结：本研究展示了应用3D网络工具（gen3DNet）处理复杂多组学数据可提取少量有意义特征并进一步构建数据驱动假设，从而使研究人员能够理论化姜黄素在乳腺癌中的潜在表观遗传信号通路。本研究主要分析MCF7细胞系（类似Luminal A（ER+、PR+）乳腺癌亚型）的蛋白质组数据，发现对该特定乳腺癌亚型中姜黄素治疗相关的组蛋白PTM和磷酸化蛋白质变化具有潜在应用。在姜黄素表观遗传介导的分析中，胸腺生成素（TMPO）作为感兴趣的磷酸化蛋白质出现。作为组蛋白-磷酸化蛋白质网络分析中top富集磷酸化蛋白质之一，TMPO是细胞核中的结构蛋白，参与基因转录、DNA复制和细胞周期控制等多种细胞过程，已被牵涉癌症进展并在包括乳腺癌在内的多种癌症中上调，其耗竭与癌细胞系细胞周期阻滞和凋亡相关。本研究中TMPO下调，可能与姜黄素抗癌活性相对应。此外，由于神经病变是乳腺癌化疗常见副作用，考虑姜黄素在介导CIPN和抑制乳腺癌中的双重作用很重要。基于本研究结果，TMPO可能在这两者中均发挥关键作用。与神经细胞系比较时，TMPO是乳腺癌（MCF7）、NPC和星形胶质细胞之间共享的富集磷酸化蛋白质之一；此外TMPO是与CIPN相关的DRG基因。鉴于其神经重要性及在细胞周期和癌症中的参与，研究人员假设TMPO是姜黄素调控的表观遗传信号级联中的潜在关键角色，需进一步生物学实验验证。在涉及TMPO的可能通路中，最可行的通路涉及转录因子ZBTB7A和磷酸化蛋白质PFKP。ZBTB7A是锌指蛋白，作为包括PFKP在内的广泛细胞增殖和分化相关基因的转录抑制因子，据报道可加速乳腺癌进展。本研究中ZBTB7A在姜黄素暴露后6小时L1000表达数据中下调，与癌症抑制相关。PFKP是糖酵解调控的关键酶，可在包括膀胱癌、乳腺癌和肺癌等某些癌症中发挥代谢重编程作用，高PFKP水平与癌症患者不良预后相关。PFKP在本研究中上调，与ZBTB7A抑制相关，但根据现有文献并不符合乳腺癌抑制。可能由PFKP招募的其他调控因子产生补偿效应。目前PFKP与TMPO之间也未有充分记录的关系，尽管两者均可定位于细胞核，需进一步研究验证此联系。此外，迄今尚无关于PFKP和TMPO与组蛋白标志H3K56me0（以及PFKP与H3K79me1之间）关系的研究。本研究建立了将组蛋白标志与乳腺癌姜黄素治疗联系起来的in silico分析，这些标志包括鉴定为姜黄素组蛋白-药物标志一部分的组蛋白PTMs的功能和调控、预测的磷酸化蛋白质-组蛋白关系以及连接乳腺癌和神经病变的基因调控信号通路。为潜在评估和验证所有这些新推断的关系，可利用更多序列驱动检测如ATAC-seq、ChIP-seq进行转录因子（TF）基序分析，这些方法可提供对PFKP和TMPO与ZBTB7A及其他上游转录因子调控相互作用的更深见解；此外CUT&RUN有助于确定感兴趣组蛋白PTMs（H3K56me0和H3K79me1）在全基因组启动子和增强子区域相关的染色质状态（蓄势或活跃）。超出本研究范围，确定因果性的下一步可包括TMPO/PFKP敲除实验并在患者来源异种移植（PDX）小鼠模型中测量乳腺癌进展，以剂量依赖方式进行功能实验也可提供对姜黄素生物活性、效力和治疗疗效的见解。本研究也揭示了回答遗传与表观遗传因素因果相互作用生物学问题时的局限性：最大局限性是各检测间缺乏一致时间点，P100与GCP采集时间差异给预测的磷酸化蛋白质-组蛋白关系留下模糊性，因组蛋白PTMs非常短暂且可在3至24小时之间快速变化。研究人员尝试用6和24小时L1000检测提供额外数据点，但RNA表达与磷酸化蛋白质水平之间的相关性也可能有限。理想情况下每种检测应在相同时间点跨多个时间点采集。缺乏数据一致性使跨多组学组分鉴定推定关联和提供因果证据更具挑战性。因此in silico酶通路建模受不完整多组学数据、参数不确定性和依赖相关性而非因果关系的限制。酶丰度可能不反映催化活性，原因包括调控复杂性（翻译后调控、变构效应或亚细胞区室化）。此外癌症特异性通路重连和数据噪声可影响预测，需谨慎解释和实验验证。因此计算预测应被解释为假设生成，需严格实验验证以建立转化相关性。最后，姜黄素跨细胞系研究的一些关键混杂因素包括：细胞系遗传改变常驱动表观遗传改变、剂量和暴露持续时间、主转录程序对p300/CBP的依赖性以及姜黄素在细胞内的生物利用度。患者对姜黄素表观遗传反应的变异性取决于多种因素，即遗传背景、生活方式因素和代谢差异。编码表观遗传酶的基因个体差异可决定姜黄素作为生物活性剂的有效性。姜黄素已知生物利用度差，代谢的“患者间”差异可大幅改变循环浓度。
研究结论部分翻译：总之，本研究提供了一种系统方法来描绘组蛋白标志并生成关于姜黄素暴露相关表观遗传信号关联的数据驱动假设。研究人员通过使用gen3DNet网络分析流程鉴定药物-组蛋白标志并预测组蛋白-磷酸化蛋白质相互作用实现了这一目标，最终结果产生了姜黄素、磷酸化蛋白质和组蛋白密码之间的连接图。这些推断的组蛋白-磷酸化蛋白质关系在考虑任何治疗或生物标志物应用之前需要实验验证。本研究分析并描绘了乳腺癌（MCF7细胞系）中与姜黄素相关的多达50余种组蛋白密码，并将这些组蛋白PTMs与姜黄素治疗联系起来。此外，研究人员还发现姜黄素在乳腺癌中的表观遗传候选物与神经系统疾病之间可能存在联系，提示这些疾病利用潜在的共同表观遗传通路。总体而言，本研究阐明了姜黄素作为乳腺癌和其他疾病表观遗传调节剂的可能新候选物，有待进一步验证。
