《Biomaterials Science》：Combining alum with a TLR7-nanoparticle adjuvant enhances vaccine-elicited humoral and cellular immunityOpen Access
编辑推荐：
互补佐剂机制的合理整合为克服免疫优势（immunodominance）并同时增强疫苗诱导的体液免疫与细胞免疫提供了一种有前景的策略。本研究中，研究人员考察了将氢氧化铝（aluminum hydroxide, Alum）与先前开发的用于胞内递送Toll样受体7激
互补佐剂机制的合理整合为克服免疫优势（immunodominance）并同时增强疫苗诱导的体液免疫与细胞免疫提供了一种有前景的策略。本研究中，研究人员考察了将氢氧化铝（aluminum hydroxide, Alum）与先前开发的用于胞内递送Toll样受体7激动剂（Toll-like receptor 7 agonist, TLR7-NP）的纳米粒平台联合使用，如何重塑早期抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）应答及下游适应性免疫。免疫后，Alum与TLR7-NP的联合使用拓宽了B细胞及多种树突状细胞亚群（包括常规1型树突状细胞（conventional type 1 dendritic cells, cDC1）、常规2型树突状细胞（conventional type 2 dendritic cells, cDC2）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDC））的抗原获取，同时促进其在引流淋巴结（draining lymph nodes）中的激活。这些早期应答之后伴随着浆母细胞（plasmablast）扩增增强、生发中心（germinal center, GC）B细胞应答增强以及滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cell, Tfh）分化增强。值得注意的是，纳米粒介导的TLR7信号促进针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）刺突蛋白保守的免疫亚优势S2亚基的生发中心应答，而与Alum联合进一步放大了该应答的强度。联合配方因此加速了S2特异性抗体的生成，并产生针对多种冠状病毒刺突蛋白的最强早期交叉反应性抗体应答。此外，Alum与TLR7-NP协同增强产生γ-干扰素（IFN-γ）和颗粒酶B（granzyme B, GZMB）的CD4+和CD8+ T细胞应答。综上，这些发现表明将Alum介导的佐剂性与纳米粒介导的胞内TLR7信号相结合，可重塑抗原呈递细胞参与以增强抗体广度和细胞免疫，为下一代疫苗中联合互补生物材料基佐剂（biomaterial-based adjuvants）提供了设计原则。
理想的预防性疫苗开发需要同时诱导强效的体液免疫和细胞免疫，以全面防护细胞外病原体和细胞内感染。在体液免疫中，产生针对高度可变病毒区域与保守病毒区域两者的多样化抗体库，对于赋予针对快速突变病原体（如流感病毒和冠状病毒）的广泛保护尤为关键。然而，许多已获批的疫苗因生发中心（germinal center, GC）内的免疫优势（immunodominance）这一根本性挑战而无法满足这些免疫学要求。免疫优势是指基于亲和力的克隆竞争在GC内有利于B细胞靶向免疫优势表位，从而排挤针对亚优势但保守区域的克隆。因此，这些疫苗往往产生针对高度可变免疫优势表位的窄特异性抗体应答，而这些表位易被新出现的变异株逃逸。此外，许多已获批疫苗还缺乏诱导完全病毒清除所需的细胞免疫的能力。
为克服这些挑战，合理设计的佐剂被纳入疫苗配方以塑造适应性免疫反应的多个方面。铝盐（包括氢氧化铝和磷酸铝，统称铝佐剂（alum））仍然是临床上最常规且应用最广泛的佐剂。虽然铝佐剂成功诱导初始抗体产生，但它被证明优先促进Th2偏向的免疫应答。铝佐剂佐剂的疫苗经常无法诱导针对亚优势和保守病毒区域的多样化抗体应答，也无法诱导细胞内防护所需的强效CD8+ T细胞应答。尽管小分子TLR激动剂存在全身毒性和脱靶细胞因子释放等临床转化障碍，生物材料基递送策略通过空间限制免疫激活提供了有力的解决方案。受不同佐剂平台互补作用机制的启发，将常规铝佐剂与生物材料基TLR激动剂佐剂联合使用引起了极大关注。然而，这些联合效应的免疫学机制尚不清楚。由于抗原呈递细胞是先天TLR感知与下游B细胞和T细胞命运之间的关键连接，研究人员假设铝佐剂与TLR7-NP的组合可能从根本上调节不同APC亚群的抗原捕获并直接增强其激活，从而塑造下游B细胞和T细胞命运。
研究人员开展了以下关键技术方法：通过gardiquimod（TLR7激动剂）引发丙交酯开环聚合合成TLR7-PLA，随后与甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（mPEG-PLGA）通过纳米沉淀法组装制备TLR7纳米粒（TLR7-NP）；采用荧光标记的模型抗原和抗原四聚体探针，结合流式细胞术在引流淋巴结中追踪抗原摄取及B细胞、树突状细胞亚群、T细胞的应答；通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量检测针对多种冠状病毒刺突蛋白的抗原特异性血清IgG及交叉反应性抗体。所有动物实验均在8至12周龄雌性C57BL/6小鼠（样本来源于The Jackson Laboratory）中开展，小鼠被随机分配至各处理组。
研究结果部分如下：
TLR7-NP与Alum佐剂的制备及理化表征
研究人员通过gardiquimod引发的开环聚合合成TLR7-PLA并经高效液相色谱（HPLC）证实gardiquimod成功偶联。动态光散射（DLS）显示TLR7-NP水动力直径为96.2 nm且分布狭窄（多分散指数PDI = 0.08），而Alum水动力尺寸约1.1 μm且分布较宽（PDI = 0.21）。Zeta电位分析显示TLR7-NP带负电荷，Alum带正电荷。
铝佐剂与TLR7-NP联合增强B细胞及树突状细胞亚群的抗原捕获与激活
使用FITC标记卵清蛋白（FITC-OVA）作为模型抗原追踪细胞摄取，结果显示Alum与TLR7-NP联合产生协同效应，显著增加了引流淋巴结中摄取抗原的B细胞总数，表明联合佐剂主要扩大可获取抗原的B细胞总体池。两种含TLR7-NP的配方均显著增加CD86+ FITC-OVA+ B细胞数量并提升CD86平均荧光强度（MFI）。在常规树突状细胞亚群中，联合佐剂同样扩大了摄取抗原的cDC1和cDC2细胞总体池，而MFI变化有限。pDC对TLR7-NP介导的刺激表现出更强反应，两种含TLR7-NP的配方均显著提高FITC-OVA MFI并伴随CD86+抗原捕获pDC的扩增，这与pDC固有高表达TLR7受体的特性相符。
铝佐剂与TLR7-NP联合增强早期生发中心及滤泡外B细胞应答
第7天分析显示，联合佐剂协同驱动最强浆母细胞扩增，显著增加S1/RBD和S2特异性浆母细胞数量。GC B细胞分析表明，所有佐剂均扩增免疫优势S1/RBD特异性GC B细胞，但仅含TLR7-NP的配方显著增加亚优势S2特异性GC B细胞，Alum单独无法实现此效应。联合佐剂还显著扩增滤泡辅助性T细胞（Tfh），表明联合佐剂最优协调B细胞与T细胞 compartments以支持早期GC反应。
铝佐剂与TLR7-NP联合增强抗体应答的强度与广度
第7天即检测到针对全长刺突蛋白和免疫优势RBD区域的可检测IgG，而Alum单独和单独刺突对照到第7天均未诱导可检测S2特异性IgG。联合佐剂在所有小鼠中诱导强S2特异性抗体应答。第14天联合佐剂对RBD、S2和全长刺突蛋白产生最高IgG效价。针对SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-HKU1和HCoV-NL63刺突蛋白的交叉反应性抗体检测显示，联合佐剂产生最高且最一致的交叉反应性应答，显著优于TLR7-NP单独。第21天加强免疫后，佐剂依赖差异在高免疫原性表位上减小，但针对难以靶向的亚优势病毒区域的差异仍然显著。
铝佐剂与TLR7-NP联合增强T细胞应答
联合佐剂诱导最强IFN-γ+CD4+ T细胞应答，并驱动GZMB+CD4+ T细胞的显著扩增，而Alum或TLR7-NP单独均未实现此效果。CD8+ T细胞方面，联合佐剂产生最大IFN-γ+CD8+ T细胞扩增及最高GZMB+CD8+ T细胞绝对数量，显著优于所有其他组。这些稳健的CD8+ T细胞应答与增强的cDC1亚群抗原摄取和激活相符，cDC1 specializes于抗原交叉呈递和CD8+ T细胞启动。
讨论与结论部分，研究人员总结认为，合理联合佐剂促进广泛抗原捕获并增强多种抗原呈递细胞群激活，从根本上塑造下游体液和细胞免疫。纳米粒递送的胞内TLR7信号对克服GC免疫优势至关重要。通过增强针对保守、免疫亚优势S2亚基的GC B细胞应答，TLR7-NP显著拓宽了早期针对多种冠状病毒的抗体交叉反应。TLR7-NP驱动免疫广度的同时，其共配方与Alum作为互补倍增器放大应答强度。这种组合协同最大化总体和抗原特异性GC反应、快速抗体产生以及CD4+和CD8+效应T细胞的稳健扩增。通过展示工程化生物材料佐剂平台如何主动编程免疫细胞相互作用，特别是整合抗原捕获与胞内TLR7介导的激活以协调全面免疫，本研究为下一代疫苗设计提供了合理的机制指导方针。
