《The Veterinary Journal》：Ecdysterone concentrations in horses following treatment and withdrawal of this naturally occurring prohibited anabolic steroid
编辑推荐：
天然存在的禁用物质的出现给反兴奋剂机构、马主和饲料公司带来了挑战。由于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的高灵敏度，天然存在的化合物如来自大麦和其他植物的大麦芽碱、来自苦橙的辛弗林、来自蘑菇的蟾毒色胺以及来自罂粟种子的吗啡，或其代谢物，即使在低浓度（例如低于
天然存在的禁用物质的出现给反兴奋剂机构、马主和饲料公司带来了挑战。由于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的高灵敏度，天然存在的化合物如来自大麦和其他植物的大麦芽碱、来自苦橙的辛弗林、来自蘑菇的蟾毒色胺以及来自罂粟种子的吗啡，或其代谢物，即使在低浓度（例如低于1 ng/ml）下，也能在马的血液或尿液中被轻易检测到。为降低因意外接触禁用环境物质而受到处罚的风险，Racing Australia等管理机构已根据物质的药理学信息、其在马体内的药代动力学以及数千份检测样本的分析结果，对某些化合物允许例外或设定残留限值。然而，并非所有环境物质或所有马匹反兴奋剂机构均如此。2023年，Harness Racing New South Wales和Australian Endurance Riders Association接到三例蜕皮甾酮（20-羟基蜕皮酮，β-蜕皮酮）阳性检测结果的通报，由此引发了广泛调查。蜕皮甾酮是一种天然存在的甾体，1954年首次从家蚕中分离，并被鉴定为昆虫蜕皮激素。随后，其在甲壳类、蜗牛、多种体内寄生虫以及众多植物物种中被发现，在植物中可能起驱虫作用。蜕皮甾酮含量高的植物多年来被用于传统医学，Cyanosis vaga和C. arachnoides等物种被商业化种植以生产蜕皮甾酮提取物。纯化的蜕皮甾酮在科学研究中已被报道具有广泛的生物效应，具有治疗关节炎、糖尿病以及肝肾功能障碍等疾病的潜力。然而，蜕皮甾酮增加实验动物和牲畜生长速率和肌肉量的能力，以及近期在年轻运动员中促进肌肉力量的能力，引起了最多的关注。临床研究已开展，旨在将蜕皮甾酮用于治疗老年男性和女性的肌肉萎缩，理论上，类似益处可能出现在老年伴侣动物和马匹中，尤其是患有垂体中间部功能障碍的马匹。与此同时，鉴于其明确的合成代谢特性，蜕皮甾酮已通过互联网积极向健美人士推广，网上广告宣传超过200个品牌的蜕皮甾酮补充剂。蜕皮甾酮尚未在人类运动中被禁用，但多年来一直是世界反兴奋剂机构关注的物质，并于2020年被列入该机构的监测清单。然而，该甾体在澳大利亚、英国及许多其他司法管辖区的赛马管理机构中被归类为禁用物质，无报告限值。蜕皮甾酮也被国际马术联合会（FEI）列为禁用物质，尽管该组织自2026年1月起修订规则，新增其為特定物质的类别。该类别认可蜕皮甾酮可能通过环境暴露而非为增强马匹性能而给药的方式存在于马体内。虽然这一方法不免除马匹责任人的任何责任，但确实允许FEI在决定案件结果时具有更大的灵活性。尽管已有大量关于蜕皮激素起源、化学和生理效应的文献，涉及人类、灵长类、啮齿类、蝙蝠、鸟类、昆虫、寄生虫和牲畜，但据研究人员所知，仅有两项研究使用马匹进行。2023年，Karatt等人描述了一种使用LC-MS检测马尿和血浆中蜕皮激素的筛查方法，从而促进了赛马法医实验室的检测。2025年，研究人员所在研究组描述了马匹中蜕皮甾酮潜在环境暴露的几种来源。还使用植物提取物和马血清以及马粪便验证了一种基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的蜕皮甾酮筛查方法，由于口服摄入后肠道对蜕皮甾酮吸收不良，马粪便中可能含有高浓度蜕皮甾酮。研究人员的总体目标是帮助马兽医和马主理解和监测该甾体环境暴露的风险。本研究在此研究基础上，通过以下方式为未来的兽医和法医工作提供支持：（i）测量接受治疗的Standardbred马匹中蜕皮甾酮的浓度，以确定排泄时间和每日给药后血液中蓄积的可能性；（ii）检验某些马匹中观察到的异常高蜕皮甾酮浓度与肠道吸收增加一致的假设；（iii）使用LC-MS确定使用基于抗体的ELISA方法获得的意外结果是否可由测定干扰解释。
研究背景方面，天然存在的禁用物质对反兴奋剂机构、马主和饲料企业构成持续挑战。由于LC-MS的高灵敏度，即使低于1 ng/ml的天然化合物及其代谢物也可在马血液或尿液中轻易检出。2023年，Harness Racing New South Wales和Australian Endurance Riders Association接到三例蜕皮甾酮阳性通报，引发广泛调查。蜕皮甾酮是一种天然存在的甾体，为昆虫蜕皮激素，存在于甲壳类、蜗牛、体内寄生虫及众多植物中，具有合成代谢特性，被赛马管理机构列为禁用物质，但可通过环境途径暴露。目前马匹中蜕皮甾酮的药代动力学数据极为有限，仅有Karatt等（2023）的筛查方法研究和Sillence等（2025）的环境暴露来源研究。因此，有必要开展研究以确定给药后排泄时间、蓄积可能性、个体差异原因以及ELISA与LC-MS检测结果的一致性，为兽医和法医工作提供依据。
研究人员开展了三项研究。研究1为干预性药代动力学研究，从The University of Queensland招募8匹Standardbred马（4匹母马、4匹阉马），分三阶段进行：阶段1单次口服蜕皮甾酮（5 mg/kg BW），阶段2每日给药7天，阶段3停药观察9天，通过ELISA测定血清和粪便中免疫反应性蜕皮甾酮浓度，采用非房室模型估算药代动力学参数。研究2在澳大利亚新南威尔士州一个阿拉伯马繁育场对17匹马（16匹阿拉伯马或阿拉伯杂交马、1匹夸特马）进行口服葡萄糖耐量试验当日给予单次口服蜕皮甾酮，于给药前和给药后40分钟采集血样，以识别对蜕皮甾酮呈现异常高反应的个体。研究3将研究2的34份样本及研究1中6匹马前36小时的96份样本用LC-MS/MS复测，以确定ELISA所测异常高浓度是否由测定干扰所致。研究结论显示：蜕皮甾酮在马体内的行为复杂，可能部分由于肠肝循环；与其他合成代谢类固醇相比，蜕皮甾酮半衰期短，口服剂量5 mg/kg BW在给药后32小时内清除；重复给药后该甾体不在血液中蓄积；但基线浓度及单次给药后浓度在馬匹间存在显著变异。半数马匹出现至少一次非典型结果。除肠肝循环外，异常高的蜕皮甾酮峰可 seemingly 随机间隔地在血液中出现和消失。因此，在充分理解蜕皮甾酮在马体内的行为之前，需要进一步研究其潜在暴露来源（包括植物和寄生虫）及代谢。尽管ELISA在某些情况下可能受到干扰并产生假阳性结果，但作为快速、灵敏且相对廉价的研究和筛查工具仍有用，而非法医案件的确定性或确证方法。结合先前关于植物摄入和内寄生虫影响的环境暴露研究，显然需要进一步研究以支持当局设定适当的报告限值或残留限值。同时，本研究表明，马匹可能需要频繁给予蜕皮甾酮才能获得该化合物在兽医学中的任何临床益处。重要意义在于为反兴奋剂机构制定报告阈值提供科学依据，为兽医理解环境暴露风险提供参考，并明确了ELISA筛查与LC-MS确证的方法学定位。
关键技术方法方面，研究采用三项主要技术：一是基于ELISA的蜕皮甾酮免疫反应性测定，用于血清、粪便和干草样本的定量筛查，血清样本无需提取直接测定，粪便和干草样本经甲醇-乙醇水混合液超声提取后测定；二是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）确证方法，采用固相萃取（SPE）前处理，以D4-氢化可的松为内标，多反应监测（MRM）模式检测；三是非房室药代动力学模型分析，使用Phoenix WinNonlin软件估算末端半衰期、峰浓度、达峰时间和表观分布容积等参数。样本队列来源包括The University of Queensland的8匹Standardbred马和澳大利亚新南威尔士州阿拉伯马繁育场的17匹马。
研究结果方面，第一，Study 1: Ecdysterone administration（研究1：蜕皮甾酮给药）。基线血清免疫反应性蜕皮甾酮浓度在馬匹间变异超过200倍（<0.1至21.2 ng/mL），粪便变异仅3.2倍（260至820 ng/g），粪便中位浓度（450 ng/g）为血清（2.5 ng/mL）的180倍。单次口服给药后5分钟内即可检测到血清蜕皮甾酮升高，基于中位值的第一个峰（36 ng/mL）出现在平均40分钟，第二个峰（43.2 ng/mL）出现在4小时，但个体间变异显著，第一峰范围10至79 ng/mL（一匹离群马达518 ng/mL），第二峰范围9至134 ng/mL（出现于2至24小时）。药代动力学参数（均值±标准误）为：末端半衰期4.26±1.82小时，峰浓度52.3±30.03 ng/mL，达峰时间6.17±8.08小时，表观分布容积1.19±0.74 L/kg。每日给药7天期间未观察到明显血清蓄积，中位浓度在5.2至9 ng/mL间波动。停药后中位浓度范围为2.6至6.1 ng/mL。粪便中蜕皮甾酮最高中位浓度（3.1 μg/g）出现在首次给药后12小时，每日给药期间稳定在1.22至1.66 μg/g（约为给药前中位值的3倍），停药后逐渐下降，末次给药7天后所有马匹恢复至给药前水平。第二，Study 2: Individual responses to ecdysterone administration（研究2：个体对蜕皮甾酮给药的反应）。17匹马中10匹在四次采样中的一次、两次或三次出现极高蜕皮甾酮浓度，部分样本经ELISA重复测定多达四次以确认结果可重复。第三，Study 3: Comparison of ecdysterone measurements using ELISA and LC-MS（研究3：ELISA与LC-MS测定结果的比较）。研究2中8份ELISA异常高值样本经LC-MS复测均确认为高浓度，排除了ELISA干扰的伪影可能；ELISA与LC-MS结果高度一致（r=0.91，P<0.001）。研究1中ELISA所见的6/7次意外峰值经LC-MS确认存在，表明同一马匹出现多个峰并非ELISA干扰所致；两方法总体相关性中等偏强（r=0.76，P<0.001），但数据中"噪声"较多，主要归因于2号马；去除2号马后相关性提高至r=0.90（P<0.01）。2号马经ELISA测定的中位浓度显著高于其余马匹（70 vs 14 ng/mL，P<0.001），但经LC-MS测定则无显著差异（28 vs 19 ng/mL，P=0.910），证实2号马为离群值，其ELISA结果可能受内源性蜕皮甾酮样物质交叉反应影响。经回归方程校正后，ELISA测定的最大浓度（42.6 ng/mL）略低于LC-MS（50.7 ng/mL），但达峰时间相似（给药后1至2小时），消除速率相近。
讨论部分总结：给药研究期间，全部8匹马在给药前血清和（或）粪便中即检测到变异浓度的蜕皮甾酮，其来源不明；若采用2 ng/mL的报告阈值，半数马匹在参赛检测时将返回不良分析结果。给药后血清蜕皮甾酮的大幅变异与人类和实验动物研究一致，表明蜕皮甾酮口服生物利用度低，肠道吸收量的微小差异（如从1%至5%）即可解释血清浓度的显著（5倍）差异。给药后血清浓度的不规则模式与蜕皮甾酮经历肠肝循环的既往结论一致，但马匹无胆囊，循环模式可能与其他脊椎动物不同。本研究末端半衰期4.26小时落在既往报道的宽泛范围（绵羊静脉给药12分钟、小鼠静脉给药9分钟、绵羊口服给药24分钟、人类口服给药9小时）之内，但个体变异大且可能存在肠肝循环，外推时需谨慎。大鼠研究提示蜕皮甾酮药代动力学可能存在性别差异，但本研究中未显现，惟每组动物数量少且使用阉马而非公马。研究1中1号马给药后5分钟即出现极高浓度（518 ng/mL），ELISA重复测定结果一致，LC-MS确认最大峰确实出现于5分钟但数值低9倍，其余时间点两方法一致性可接受。2号马经ELISA测定基线浓度高（21.2 ng/mL）且维持至第19天，中位浓度显著高于同群马匹，但LC-MS测定浓度远低，证实ELISA受交叉反应干扰，该内源性蜕皮甾酮样物质来源尚待鉴定，文献提示蜕皮甾酮可由蠕虫产生，后续研究探索了内寄生虫感染的可能性。研究2中三匹马给药后出现极高浓度符合肠道吸收差异的预测，但两匹马给药前亦出现极高浓度，与饮食、体重、年龄或性别无关，提示异常高浓度以尖峰形式偶发出现，源于内源性蜕皮甾酮产生（如内寄生虫）或从储存部位释放入血，而非与口服给药和（或）肠道吸收差异相关。血清浓度可在40分钟内快速双向变化或7小时内稳步下降，这种快速变化速率与内源性产生和短半衰期一致，而非饮食暴露。局限性包括：研究1动物数量少，至少两匹马ELISA可能受干扰；缺乏其他蜕皮激素或蜕皮甾酮代谢物的标准品，不能排除ELISA检测到蜕皮甾酮以外物质的可能性；研究1中两匹马的血清未能获取质谱数据，粪便样本未进行LC-MS分析。结论部分翻译：与其他物种一样，蜕皮甾酮在马体内的浓度行为复杂，可能部分由于肠肝循环。与其他合成代谢类固醇相比，蜕皮甾酮半衰期短，口服剂量5 mg/kg BW在给药后32小时内清除。重复给药后该甾体似乎不在血液中蓄积；然而，基线浓度及单次蜕皮甾酮给药后达到的浓度在馬匹间显示显著变异。事实上，本研究给药试验中半数马匹及后续给药研究中超过半数马匹至少返回一次非典型结果，其蜕皮甾酮浓度在治疗前（研究2）或对给药的反应中（研究1和研究2）本应被视为离群值。除肠肝循环的潜在复杂性外，本研究表明异常高的蜕皮甾酮峰可 seemingly 随机间隔地在血液中出现和消失。因此，在充分理解蜕皮甾酮在马体内的行为之前，需要进一步研究蜕皮甾酮的潜在暴露来源（包括植物和寄生虫）及蜕皮甾酮代谢。尽管观察到ELISA在某些情况下可能受到干扰并产生假阳性结果，但作为快速、灵敏且相对廉价的研究和筛查工具，而非法医案件的确定性或确证方法，ELISA仍可能有用。结合先前关于通过摄入植物和内寄生虫影响的环境暴露研究，显然需要进一步研究以支持当局设定适当的蜕皮甾酮报告限值或残留限值。同时，本研究表明，马匹可能需要频繁给予蜕皮甾酮才能获得该化合物在兽医学中使用的任何临床益处。
