BGN标记头颈部鳞状细胞癌中癌症相关成纤维细胞活化与细胞外基质重塑

《Translational Oncology》：BGN marks cancer-associated fibroblast activation and extracellular matrix remodeling in HNSCC

摘要 本研究通过整合TCGA批量RNA测序、单细胞RNA测序及空间转录组数据集，系统分析了BGN在头颈部鳞状细胞癌中的表达模式、预后意义及生物学功能。研究发现，BGN高表达与间充质评分升高以及癌症相关成纤维细胞活化、细胞外基质重塑和上皮-间充质转化相关通路的富集密切相关，同时可能降低对常用化疗药物的敏感性。BGN阳性（BGN+）的CAFs表现出显著增强的ECM重塑活性和更强的细胞间通讯潜力。与BGN阴性（BGN-）的CAFs相比，BGN+ CAFs可能具有更强的促肿瘤活性。空间转录组分析显示，BGN高表达区域优先定位于基质中，远离肿瘤核心区域。BGN可作为HNSCC中ECM/基质重塑主导型CAF状态的生物标志物。此外，与BGN敲低的CAFs共培养的肿瘤细胞表现出增殖、集落形成、侵袭和迁移能力下降，伴随EMT表型的抑制。

BGN在头颈部鳞状细胞癌中标记癌症相关成纤维细胞活化与细胞外基质重塑：一项多组学整合研究

一、研究背景与研究目的

头颈部鳞状细胞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，涵盖口腔、喉部和咽部等多个解剖部位的上皮源性实体瘤。其发病与烟草、酒精暴露、人乳头瘤病毒和EB病毒感染、咀嚼槟榔等不良生活习惯以及不合适的口腔修复体持续刺激有关。HNSCC在所有恶性肿瘤中发病率位居第六，具有侵袭性强、淋巴结转移率高的特点，尽管治疗策略不断进步，患者预后和生活质量仍不理想。局部淋巴结转移是决定预后的核心因素，因此阐明参与HNSCC侵袭和转移的调控蛋白对于寻找有效治疗靶点、减少复发转移、改善长期生存至关重要。

肿瘤微环境是一个高度结构化的生态系统，包含癌细胞、多种非上皮细胞以及大量生物活性成分。细胞外基质作为TME的关键组分，是由胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等多种糖蛋白构成的网络，主要由基质细胞分泌。癌症相关成纤维细胞是TME中最常见的基质细胞，它们分泌基质金属蛋白酶、MMPs抑制剂、多种细胞因子和生长因子，是调节ECM最重要的细胞群体。CAFs与肿瘤细胞和免疫细胞广泛相互作用，促进HNSCC的转移、治疗抵抗和免疫治疗耐药。例如，CAFs通过分泌外泌体诱导CD8⁺ T细胞排斥和调节性T细胞富集，并显著上调肿瘤细胞中PD-L1的表达。此外，CAFs可通过分泌转化生长因子-β和白介素-6等多种活性成分促进肿瘤细胞发生上皮-间充质转化。越来越多的研究证实，靶向CAFs及其分泌的生物活性致癌分子可能是一种有吸引力的治疗策略。

小型富含亮氨酸蛋白聚糖是蛋白聚糖的一个特殊亚类，广泛存在于ECM中，由17个成员组成，参与细胞生长和信号转导的调控。SLRPs可由CAFs合成并分泌到细胞外，随后进入ECM，与靶细胞上的细胞外受体结合并启动下游信号传导。BGN是SLRP家族的一员，通常定位于ECM，在多种生理过程中发挥关键作用，也参与多种肿瘤的发生、发展和转移。例如，有研究证明胰腺导管腺癌中的BGN可通过影响TGF-β信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。尽管已有生物信息学研究报道BGN在HNSCC中高表达，但其具体作用仍不清楚。

为此，研究人员开展了这项综合性生物信息学分析，整合批量RNA测序、单细胞RNA测序和空间转录组数据集，旨在全面表征BGN在HNSCC中的表达模式、临床意义及潜在生物学功能。

二、主要关键技术方法

研究人员从以下公共数据库获取数据进行分析：TCGA-HNSCC队列的RNA-seq数据及临床信息、GEO数据集GSE6631用于外部验证、GSE234933和GSE103322用于单细胞分析、GSE252265用于空间转录组分析。采用ESTIMATE、ssGSEA、MCP-counter、xCell、EPIC、IPS和quanTIseq七种计算方法评估肿瘤微环境组成。利用OncoPredict基于GDSC2数据库预测化疗药物敏感性。运用Seurat进行单细胞数据处理、聚类和注释，CellChat分析细胞间通讯，Monocle3进行伪时间分析，scTenifoldKnk执行虚拟基因敲除。空间转录组数据通过Seurat导入和分析，使用spdep计算空间自相关性。

三、研究结果

1. BGN在HNSCC中显著上调并与不良预后相关

泛癌分析显示BGN在包括HNSCC在内的10种肿瘤类型中显著高表达。在TCGA-HNSCC队列和独立GEO验证集中，肿瘤组织BGN表达均显著高于正常组织。BGN表达在不同TNM分期中存在显著差异，IVb期肿瘤表达最高。Kaplan-Meier生存分析表明BGN高表达组中位总生存期更短。BGN表达与成纤维细胞和内皮细胞丰度呈正相关，与T细胞浸润呈负相关。免疫组化染色证实BGN阳性染色主要定位于瘤周基质区室。蛋白质水平验证同样显示BGN在肿瘤组织中高表达，且与较差预后显著相关。

2. BGN与ECM重塑和基质活性密切相关

GSEA分析显示BGN相关基因显著富集于EMT、ECM-受体相互作用和黏着斑通路。七种算法评估TME的结果一致表明，BGN高表达组具有更高的CAFs和巨噬细胞丰度、更低CD8⁺ T细胞丰度，且基质评分和ESTIMATE评分更高、肿瘤纯度更低。六条主要TME相关通路——CAF活化、ECM重塑、EMT、缺氧、血管新生和TGF-β信号——在BGN高表达组中活性评分显著更高。BGN表达与CAF活化、ECM重塑和EMT相关核心基因显著正相关。BGN高表达组还表现出独特的免疫检查点分子表达谱，并对顺铂、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇和5-氟尿嘧啶等常用化疗药物敏感性降低。WGCNA鉴定出与BGN最强正相关的MEbrown模块。

3. BGN主要来源于CAFs并与ECM重塑密切相关

单细胞RNA测序将细胞分为八类主要群体后，发现约3.8%的细胞表达BGN，且表达几乎完全局限于成纤维细胞群体，少量在内皮细胞中检测到。虚拟BGN敲除实验预测受扰动最大的基因包括CCL4和CFD等，GO富集分析显示这些基因显著富集于ECM组织、细胞外结构组织和外部包裹结构组织等通路，提示BGN在ECM重塑中发挥关键作用。

4. BGN+ CAFs表现出增强的促肿瘤活性

伪时间分析显示BGN表达与CAF分化之间仅存在弱正相关，表明BGN并非CAF分化的主要驱动因素。GSEA分析显示BGN+ CAFs主要富集于EMT、血管新生和凝血相关通路。GO分析表明BGN+ CAFs主要与ECM组织、细胞外结构组织和外部包裹结构组织相关。CellChat分析显示，作为信号发送者，BGN+ CAFs在所有六种细胞类型中展现出显著强于BGN- CAFs的信号输出强度，而BGN表达对CAFs的信号接收强度无明显影响。BGN+ CAFs的整体通讯概率明显更高，表明其在TME中具有更活跃的信号状态和更大的调控潜力。

5. BGN可作为ECM/基质重塑的标志物

对成纤维细胞群体进一步降维和注释后，共鉴定出15个CAF簇并归类为七个功能亚群。BGN在多个CAF簇中均有表达而非局限于单一亚群。样本平衡配对分析显示，BGN阳性细胞的Matrix/ECM程序评分显著更高，而炎症性CAF程序评分则呈负向偏移。这表明BGN表达优先与ECM/基质重塑主导的CAF转录状态相关，而非特定CAF亚型。独立验证队列GSE103322的分析结果与此一致。

6. BGN富集于CAF和基质丰富区域并与TME重塑密切相关

空间转录组分析显示，BGN高表达区域主要定位于ECM丰富区域，远离肿瘤核心。距离分析证实BGN高表达斑点距肿瘤核心显著更远，优先分布于基质丰富区域。差异表达分析和功能富集表明BGN高表达区域主要与ECM组织、细胞外结构组织和外部包裹结构组织相关。跨样本汇总分析显示，BGN在七个样本中呈现显著的空间自相关性。BGN表达与成纤维细胞和胶原相关基因呈强正相关，与肿瘤核心标志物相关性弱或为负。BGN与CAF-基质和ECM-重塑模块在所有样本中均呈正相关。

7. BGN是CAFs促肿瘤效应的关键介质

从新鲜切除肿瘤组织中分离培养原代CAFs，通过siRNA敲低BGN表达后与HN6细胞共培养。与对照相比，与BGN敲低CAFs共培养的HN6细胞增殖能力、集落形成能力、侵袭和迁移能力均显著降低，同时E-钙黏蛋白表达增加、波形蛋白表达减少，表明EMT表型受到抑制。

四、讨论与结论

讨论部分指出，由于咀嚼槟榔、吸烟饮酒等风险因素以及HPV感染流行，HNSCC发病率居高不下，且公众防癌意识不足常导致患者就诊时已处于中晚期。本研究首次整合批量转录组、单细胞RNA测序和空间转录组分析，全面表征了BGN在HNSCC中的表达模式和空间分布。BGN在RNA和蛋白水平均显著上调，高表达与不良长期生存密切相关。多种分析方法一致表明BGN与ECM重塑密切相关，且BGN高表达组对多种常用化疗药物敏感性降低。单细胞分析揭示BGN主要由CAFs表达，BGN+ CAFs具有更强的细胞间通讯能力和ECM重塑活性。空间转录组分析证实BGN高表达区域定位于基质区室，与成纤维细胞和胶原相关基因共定位。体外实验证明CAFs来源的BGN在促进肿瘤细胞恶性行为和EMT中发挥重要作用。此外，BGN表达与CCL4和CFD呈负相关，提示高BGN表达的ECM重塑可能损害免疫细胞浸润并促进免疫耐受。

研究结论：BGN主要定位于肿瘤基质和ECM中，主要由CAFs表达。BGN+ CAFs与肿瘤发生过程中CAF活化增强、ECM重塑、EMT促进和免疫抑制相关。这是首次整合批量转录组、单细胞RNA测序和空间转录组分析全面表征BGN在HNSCC中表达模式和空间组织的研究。BGN可作为HNSCC中CAF活化和ECM重塑的生物标志物。这些发现表明BGN是一个值得进一步功能验证的潜在治疗靶点。