Eggshell/Ag0/PEG/壳聚糖纳米复合物：一种用于HEK-293T细胞基因递送的良好生物相容性载体

《Results in Chemistry》：Eggshell/Ag0/PEG/chitosan nanocomposite: A biocompatible carrier for gene delivery to HEK-293T cells

近年来，纳米技术在疾病诊断与治疗等生物医学领域已成为最具新颖性的解决方案。基因治疗通过将治疗性基因导入靶细胞，从而减少对药物或手术的需求并降低对患者的伤害，是治疗遗传缺陷的有力策略。基因治疗与纳米技术的融合近来为改善临床结局创造了新机遇。本研究采用温和便捷的共沉淀法成功合成了新型蛋壳/Ag⁰/聚乙二醇/壳聚糖纳米复合物，并评价其作为向HEK293-T细胞进行基因递送的高潜力载体。通过XRD、FTIR、EDX、FESEM和TEM分析对蛋壳/Ag⁰/聚乙二醇/壳聚糖纳米载体的化学结构与组成进行了全面表征，确认了所合成纳米复合物24–35 nm的平均粒径及其结构。评估了DNA结合亲和力与质粒转染效率。值得注意的是，单独使用裸质粒处理HEK 293-T细胞后未发生转染。毒性评价表明该新型纳米载体对细胞无毒性，细胞凋亡实验表明细胞凋亡无显著增加，使其成为携带基因的高效载体，在基因治疗中具有潜在应用价值。

基因治疗是一种利用治疗性基因预防或治疗疾病的技术，通过将基因递送至靶细胞而非使用药物和手术来治疗缺陷，对人体造成的伤害最小。近年来，包括陶瓷、氧化钛和氧化铁纳米颗粒、聚合物纳米材料等多种纳米材料在生物医学与临床领域已有大量应用。由于游离DNA可被血液中的核酸酶快速降解，且裸DNA与细胞膜均带负电荷，二者之间的排斥性静电相互作用限制了DNA进入细胞。基因递送载体一般分为病毒型与非病毒型两类。病毒载体存在生产与质量控制困难、因毒性和免疫反应导致安全性低等主要缺点；非病毒载体则具有安全性改善、基因装载容量高、制备简单及无免疫原性等优势。近年来，具有高DNA亲和力的金属基纳米结构正成为开发治疗剂特别是非病毒基因递送的重要且具吸引力的选择。其中，银纳米颗粒因其公认的抗菌活性被广泛应用于各种临床场景，且对哺乳动物细胞具有独特的细胞毒性特征，使其适用于细胞与肿瘤治疗。此外，蛋壳近来作为另一种有前景的生物相容性材料在生物医学应用中崭露头角。蛋壳是一种丰富、低成本的生物废弃物，全球食品加工与家庭来源每年产生约800万吨。除减少废弃物外，蛋壳来源的碳酸钙（CaCO₃）为纳米载体开发提供了独特优势，如天然介孔结构、高比表面积、优异的生物相容性、受控的pH响应性降解特性以及通过静电相互作用进行表面功能化的能力。与合成CaCO₃不同，生物源性蛋壳保留了微量有机基质蛋白，可能有助于增强细胞相互作用并降低免疫原性。聚乙二醇（PEG）是一种由水和环氧乙烷化学反应制成的合成聚合物，具有水溶性，在制药工业等领域有广泛应用。壳聚糖（Cs）是在碱性条件下由甲壳素制成的聚合物，是含量最丰富的氨基多糖，其高生物相容性、低毒性、可生物降解性和抗菌特性使其应用于医学包括组织工程及药物和基因递送。壳聚糖可与质粒形成强结合，良好保护核酸免受血液中核酸酶的降解。将蛋壳、AgNO₃、PEG和壳聚糖四种组分组合为单一纳米复合物体系，旨在实现基因递送应用的协同功能：蛋壳作为生物相容性多孔核心支架，银纳米颗粒提供抗菌与治疗特性，PEG增强胶体稳定性并防止团聚，壳聚糖通过静电相互作用促进DNA结合并保护核酸免受降解。本研究采用共沉淀法合成蛋壳/Ag⁰纳米复合物，并通过涂覆聚乙二醇和壳聚糖生物聚合物使其稳定分散，形成新型纳米载体。通过XRD确认纳米载体结构，FESEM和TEM观察形貌与尺寸，DLS测量流体力学尺寸；随后通过细胞毒性实验、转染效率测试和琼脂糖凝胶电泳DNA结合分析评价其基因治疗潜力。结果表明该纳米载体兼具低毒性与高转染效率及有效DNA递送能力。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用共沉淀法合成蛋壳/Ag⁰/PEG/壳聚糖（EAPCs）纳米复合物；通过X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、能量色散X射线光谱（EDX）、场发射扫描电子显微镜（FESEM）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）及BET比表面积分析进行表征；采用琼脂糖凝胶阻滞实验评价DNA结合能力，DNase I保护实验评价核酸酶保护作用；以HEK-293T细胞为对象，采用MTT法评价细胞毒性，以GFP报告质粒进行转染实验，并用Annexin V-FITC/PI流式细胞术进行细胞凋亡分析。

BET比表面积分析：为确认蛋壳颗粒的介孔性质，采用单点BET法进行氮吸附分析，蛋壳粉比表面积约为13.49–14.02 m²/g，与先前报道的蛋壳来源材料比表面积一致，确认了多孔结构的存在，依据IUPAC分类属于介孔材料，为基因递送应用提供了高比表面积。

织构性质与孔隙率：通过77 K下N₂吸附-脱附分析研究蛋壳粉的织构性质，等温线呈IUPAC分类的IV型特征，为介孔材料的典型特征，并观察到H3/H4型滞后环，表明存在狭缝状介孔；多点BET法测得比表面积为10.01 m²/g，总孔容与平均孔径分别为0.0297 cm³/g和11.88 nm，BJH法孔径分布显示从微孔（约1.21 nm）到介孔（2–20 nm）的宽分布，确认了分级微/介孔结构。

电子显微镜研究：FESEM显示颗粒呈鳞片状形貌、分布均匀，平均粒径24–35 nm，EDS分析显示复合物含O（34.3%）、Ag（31.2%）、Ca（23.4%）和C（11.2%），确认了EAPCs纳米复合物的元素组成；TEM显示粒径约5–35 nm，并可观察到PEG与壳聚糖生物聚合物形成的织物状组织，表明颗粒在这些聚合物中具有优异的分散性与稳定性。

XRD分析：EAPCs纳米载体呈结晶结构，2θ=29.46和31.51处的峰对应蛋壳结构中CaCO₃的主要相，2θ=23.1和19.3处的峰揭示PEG结构，2θ=10.3和11.95处的低强度宽峰与壳聚糖结构相关，38.15、44.334、64.47和77.43处的峰对应金属银纳米颗粒（Ag⁰）的（111）、（200）、（220）和（311）晶面，确认合成过程中AgNO₃成功还原为Ag⁰；此外观察到若干次要峰，对应合成过程中形成的次要物相或复合物，反映了纳米复合材料的多组分性质。采用Scherrer方程（经仪器展宽校正）计算主要组分晶粒尺寸，壳聚糖为31.17±3.5 nm和52.02±5.8 nm，PEG为63.39±7.1 nm，CaCO₃为56.62±6.3 nm和55±6.1 nm，Ag⁰各晶面为46.92±5.2至91.80±10.2 nm，银峰间晶粒尺寸差异提示各向异性晶体生长。

FTIR分析：在500–4000 cm^?1范围采用KBr法测定FTIR光谱，3438 cm^?1处宽峰归因于样品结构中表面吸附水的OH和NH伸缩振动，1638 cm^?1处尖峰表明碳酸根CO带，2088 cm^?1处弱宽峰显示碳酸钙的CO伸缩，522和649 cm^?1处谱带与银相关，提示银与纳米蛋壳的连接；壳聚糖相关峰因浓度低而被其他峰重叠，最终确认了EAPCs纳米复合物的结构。

DLS与zeta电位分析：DLS显示多分散颗粒的流体力学直径主要在176–288 nm范围，归因于颗粒周围形成明显水分子层且纳米蛋壳介孔性质因强氢键作用而增强；合成的EAPCs纳米载体zeta电位约为+14 mV，正表面电荷归因于壳聚糖骨架上质子化氨基（-NH₃⁺），不仅提供带正电的载体，还促进与质粒DNA带负电磷酸骨架的静电相互作用，提高DNA装载量并更好地防止酶降解；PEG涂层提供额外空间稳定作用，确保长期胶体稳定性。

琼脂糖凝胶DNA结合能力研究：凝胶阻滞实验显示，裸DNA（泳道2）自由迁移通过凝胶，而EAPCs纳米载体与质粒DNA混合（泳道3）后质粒DNA完全滞留于加样孔中，表明质粒DNA与EAPCs纳米复合物完全结合，最佳相互作用在N/P=1时观察到；壳聚糖骨架的氨基赋予纳米载体正电荷，与带负电质粒DNA产生静电相互作用。

DNase I保护实验：经DNase I处理的裸质粒DNA（泳道2）被完全降解，而使用纳米载体（N/P=1）时观察到有效保护（泳道4），该保护归因于壳聚糖涂层通过静电相互作用在质粒DNA周围形成部分物理屏障，阻止酶接近，确认EAPCs纳米复合物有效保护质粒DNA免受核酸酶降解。

EAPCs纳米载体毒性评价：暴露24和48 h后，细胞活力呈浓度和时间依赖性下降；24 h后25 μg/mL时细胞活力约90%，并随纳米复合物浓度增加逐渐下降；48 h后尤其在100和150 μg/mL时下降更为明显；总体而言，纳米复合物在较低测试浓度下维持较高的细胞活力。

细胞转染：以HEK-293T细胞和GFP报告质粒评价EAPCs纳米复合物的转染效率，转染后24和48 h，EAPCs/GFP质粒复合物处理细胞中均清晰观察到GFP表达，表明成功的基因递送与表达；相反，单独裸质粒处理细胞中未观察到GFP表达，确认纳米载体对有效基因递送必不可少；孵育时间从24 h延长至48 h未显著改变HEK-293T细胞的转染结果；转染实验进一步表明N/P=1为最佳比例。

细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞术分析，对照组活细胞（Q3）为89.66%，EAPCs处理组为88.36%；早期凋亡细胞（Q4）对照组为5.44%，处理组为4.91%；晚期凋亡/坏死细胞（Q2）对照组为3.50%，处理组为4.14%；坏死细胞（Q1）对照组为1.40%，处理组为2.59%；结果表明与对照组相比，暴露于EAPCs纳米复合物后细胞凋亡无显著增加（P<0.01）。作为对比，Lipofectamine 2000在HEK-293T细胞中通常介导约60–80%的转染效率，但在较高剂量下表现出显著细胞毒性；相比之下，EAPCs纳米复合物在所有测试浓度下维持>88%的细胞活力，尽管转染效率较低，但提供了更好的安全性。

讨论与结论：本研究旨在开发一种安全有效的非病毒纳米载体用于向HEK293-T细胞进行基因转移，细胞膜是成功转染的主要屏障。本研究采用便捷的共沉淀法成功合成了EAPCs纳米载体，并通过XRD、FTIR、TEM、EDX和FESEM分析评估并确认了所合成纳米复合材料的结构、形状和尺寸。通过凝胶阻滞、细胞转染、MTT实验和凋亡分析评价了DNA装载能力、毒性以及所合成纳米复合物对细胞凋亡的影响。凝胶阻滞实验和DNA结合研究结果表明，DNA结合可将质粒DNA高效附着于EAPCs纳米载体，完全防止降解并保护质粒DNA免受核酸酶攻击。毒性评价表明该新型纳米载体对细胞无毒性，细胞凋亡实验显示细胞凋亡无显著增加。总体而言，研究结果表明EAPCs纳米复合物是未来体内应用中基因递送的有前景候选者。