杉木（Cunninghamia lanceolata）苗木冬季锻炼中黄酮类代谢的潜在作用：整合转录组与代谢组分析揭示其与抗寒性及早期造林表现的关联

《Plant Stress》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses reveal the potential roles of flavonoid metabolism in winter hardening and early outplanting performance of Chinese fir seedlings

冬季锻炼（winter hardening）是提升杉木（Cunninghamia lanceolata）苗木抗逆性及后续定植效果的重要苗圃措施，但与之相关的生理与分子响应仍认识不足。本研究以优良杉木无性系'杨061'苗木为材料，实施去除遮阳网并暴露于自然季节性降温的苗圃冬季锻炼处理，整合生理指标测定、代谢组学（metabolomics）分析与转录组学（transcriptomics）分析，以表征与锻炼相关的响应及其与早期造林表现的潜在关系。与遮阴对照相比，锻炼苗木表现出光合特性改变、抗氧化酶活性增强以及渗透保护性化合物积累增加。整合组学分析鉴定出黄酮类生物合成（flavonoid biosynthesis）是与冬季锻炼相关的重要代谢通路之一，尤其在1月。包括花旗松素（taxifolin）、短叶松素（pinobanksin）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷（prunin）及原花青素（proanthocyanidin）相关化合物在内的多种黄酮类代谢物积累增加，同时伴随黄酮类生物合成基因如CHS与LAR的差异表达。加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出与生理性状及次生代谢性状相关的模块及候选枢纽基因（hub genes）。田间造林试验中，锻炼苗木的存活率（82.29% vs. 71.55%）及苗高与地径生长量均高于遮阴对照。上述结果表明，苗圃冬季锻炼与协调的生理、转录及代谢调整相关，其中黄酮类代谢是该响应的显著组成部分。研究结果为理解杉木苗木对苗圃锻炼的生理与分子响应及其对早期田间定植的潜在意义提供了依据。

一、研究背景与问题

杉木（Cunninghamia lanceolata）为柏科（Cupressaceae）代表性树种，是我国南方重要商品用材树种，其造林成功对木材生产、生态修复与可持续森林经营具有重要意义。杉木苗木因根系较浅、抗逆性相对较弱，在发育早期易受环境胁迫影响，其中低温事件是限制苗木定植与人工林生产力的主要因素之一。近年来气候变化加剧了晚春冷害与霜冻等极端天气事件的频率与强度，对南方苗木存活与森林生产力构成威胁。为提升苗木质量与造林后存活率，冬前去除遮阳网诱导的冬季锻炼（winter hardening，亦称冷驯化 cold acclimation）已成为杉木育苗中广泛采用的苗圃管理措施，但其改善抗寒性的生理与分子机制仍不清楚。已有研究表明冷驯化涉及光合性能、膜稳定性、渗透调节、抗氧化防御与碳代谢的广泛改变，维持活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态是抗寒性的关键决定因素；然而越来越多证据显示仅靠酶促抗氧化系统难以在长期冷驯化中维持氧化还原稳态，提示次生代谢途径的重要性。黄酮类（flavonoids）因具较强抗氧化能力及在环境适应中的多功能作用而受到关注，已在多种草本与木本植物中被证实冷胁迫可促进其积累，但黄酮类代谢重编程是否构成杉木冬季锻炼的主要适应机制尚属未知。尽管转录组与代谢组整合分析已成功解析多种作物与木本植物的冷适应机制，但关于杉木苗圃锻炼过程中连接生理驯化、黄酮类代谢与基因表达的动态调控网络仍知之甚少。基于此，研究人员以优良无性系'杨061'苗木为对象开展本研究，旨在整合理解苗圃冬季锻炼相关的生理与分子响应及其对苗木定植的潜在意义。

二、研究方法概述

研究设置去遮阳网锻炼处理（CA，辐照度1157.82 μmol m^?2 s^?1）与遮阴对照（CK，276.49 μmol m^?2 s^?1），于2022年10月至2023年2月实施，分别于2022年10月1日、2023年1月1日与2月15日采样。材料为福建省顺昌县洋口国有林场苗圃培育的10月龄扦插苗。关键技术方法包括：光合色素与叶绿素荧光参数测定、脂质过氧化与抗氧化酶活性及渗透调节物质定量、次生代谢物含量与相关酶活性测定、广泛靶向代谢组学（UPLC-MS/MS）分析、转录组测序分析，以及田间造林试验（随机完全区组设计，3个区组、6个小区、433株苗木）评估存活与生长。

三、研究结果

3.1 冬季锻炼诱导形态与光合色素调整：锻炼苗木针叶逐渐变为黄褐色且变硬，1月变色最明显；苗高在10月至1月显著增加后趋稳，两处理间无显著差异，地径与地上生物量在1—2月以CA偏高；CA的叶绿素与类胡萝卜素含量在1—2月显著低于CK，Chl a/b比值随时间下降；荧光参数在锻炼期短暂下降后部分恢复，1月CA的F_m较CK显著降低59.96%。

3.2 对抗氧化系统与渗透调节的影响：H₂O₂含量在两处理下持续升高且CA更高，2月较10月增加134%；MDA在CA下升高而CK下降，CA始终高于CK；POD与CAT活性随时间升高并在2月达峰，后期CA显著高于CK；SOD活性在1—2月CA显著低于CK；APX活性在CA下大幅升高并于1月达峰，较CK高317.95%；可溶性蛋白在CA下1月达峰，可溶性糖在1—2月CA高于CK，脯氨酸在1月CA较高而10月与2月较低。

3.3 促进黄酮类积累并调控苯丙烷类相关酶活性：总酚、总黄酮与原花青素含量在CA下总体维持较高水平，原花青素积累响应显著；花青素在两处理下持续下降；PAL活性对锻炼响应最强，1—2月CA显著高于CK；C4H活性在1—2月CA显著升高；CHI与CAD活性在多个阶段CA低于CK，4CL无显著差异。

3.4 代谢组学鉴定黄酮类生物合成是主要代谢响应：共检测到1977种代谢物，黄酮类（525种，26.56%）与酚酸类（377种，19.07%）最丰富；CK与CA分别有531与865种代谢物在至少两个阶段差异显著，其中17与85种在所有阶段比较中一致显著；KEGG富集显示黄酮类生物合成（FBP）为最显著富集通路；CA下花旗松素1月增加951.9%，短叶松素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷与芳香二氢黄酮醇（aromadendrin）次之；跨处理比较共检测641种差异代谢物，33种共有，FBP富集频率与代谢物数量最高，多数FBP相关代谢物在CA的1月阶段（CA2）达峰。

3.5 转录组分析揭示黄酮类生物合成基因广泛激活：测序产生188.05 Gb高质量数据，Q30>94%，GC>43.1%；共注释155,151条unigene，鉴定3658个转录因子（TFs）分属92个家族，AP2/ERF、MYB-related、bHLH与C2H2最丰富；CK与CA分别鉴定24,095与24,438个差异表达基因（DEGs），FBP与苯丙烷类生物合成（PBP）为主要响应通路；CA2 vs. CK2差异基因最多，提示1月为关键转录窗口；STEM分析显示FBP相关基因在锻炼早期即升高并持续活跃。

3.6 WGCNA鉴定共表达模块与候选枢纽基因：共鉴定19个模块，turquoise（4774个）、blue（3934个）、brown（3094个）最大；yellow模块与CAT（r=0.94）、C4H（r=0.85）、CAD（r=0.84）活性强正相关，turquoise模块与花青素含量正相关（r=0.89），lightcyan模块与F_m（r=0.92）和F_v（r=0.86）强正相关；yellow模块中Cluster-80370.116、Cluster-65597.0与Cluster-51670.0为候选枢纽基因。

3.7 整合分析揭示黄酮类生物合成的协调调控：九象限分析显示除CA1 vs. CK1外，大量DEGs与DEMs分布于第1与第9象限，提示部分代谢变化可能与负向转录调控相关；KEGG富集突出FBP、黄酮与黄酮醇生物合成（FFBP）及PBP；26种DEMs中18种在CA2显著上调，以橙皮素-7-O-葡萄糖苷（hesperetin-7-O-glucoside）积累最高，仅柚皮苷（naringin）与新橙皮苷（neohesperidin）下调；CHS、F3′H、F3H、LAR与FNS I在CA2显著诱导，LAR仅在CA2特异性诱导；相关性网络在|r|≥0.8且FDR<0.05下获得495对基因—代谢物关联，高拷贝CHS与DFR分别为主要正向与负向调控枢纽。

3.8 冬季锻炼改善早期造林存活与生长：CA苗高增量56.86±2.64 cm，较CK（44.30±2.22 cm）提高28.35%（P<0.001）；地径增量7.92±0.38 mm，较CK（6.17±0.62 mm）提高28.36%（P<0.01）；存活率82.29±5.47%，较CK（71.55±1.86%）提高10.74个百分点（P<0.05）；造林后CA苗木可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD、CAT、SOD活性更高，H₂O₂含量更低。

四、讨论与结论

讨论部分指出，杉木苗木在锻炼期维持叶绿素含量甚至1月上升，提示其保持光合机构完整性而非通过叶绿素降解降低光合能力；黄褐色表型与类胡萝卜素、黄酮类及原花青素积累增加相关，提示色素重塑为长期低温暴露的适应响应。H₂O₂持续升高表明锻炼施加了适度氧化挑战，其可能作为信号线索激活下游防御，POD、CAT、SOD活性持续升高及APX在1月达峰与柑橘、菊属冷驯化中的报道类似。可溶性蛋白、可溶性糖与脯氨酸积累有助于稳定膜与蛋白、维持渗透平衡并参与ROS解毒。黄酮类为鉴定代谢物中最大类别，FBP在代谢组与转录组分析中一致富集，表明黄酮类代谢是杉木冷驯化响应的重要代谢组分，但并非唯一决定因素；黄酮类既可直接清除ROS也可调控氧化还原稳态与胁迫信号，构成对酶促防御的非酶促补充；1月（CA2）为黄酮类生物合成的关键窗口，butin、naringenin、galangin与apigenin等代表性黄酮在CA2显著高于对应CK。研究结论为：苗圃冬季锻炼与协调的生理、转录与代谢调整相关，黄酮类代谢是该响应的显著组成部分；研究结果为理解杉木苗木对苗圃锻炼的生理与分子响应及其对早期田间定植的潜在意义提供了依据。