《Poultry Science》：The effect of in ovo treatments with galactooligosaccharide and sodium butyrate on microbiota activity and mucosal proteome in the ileum and cecum of broiler chickens
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本研究旨在确定卵内刺激半乳寡糖（GOS）与丁酸钠（SB）对肉鸡回肠和盲肠肠道微生物区系活性、表观遗传事件及黏膜蛋白质谱的影响。实验选用1,068枚Ross 308种鸡受精蛋，随机分为四组：阴性对照组（NC）及三个卵内处理组，每组267枚。孵育第12天，向蛋气室
本研究旨在确定卵内刺激半乳寡糖（GOS）与丁酸钠（SB）对肉鸡回肠和盲肠肠道微生物区系活性、表观遗传事件及黏膜蛋白质谱的影响。实验选用1,068枚Ross 308种鸡受精蛋，随机分为四组：阴性对照组（NC）及三个卵内处理组，每组267枚。孵育第12天，向蛋气室注射0.2 ml无添加NaCl（阳性对照组，PC）、含3.5 mg GOS或含0.6 mg SB的溶液。第21天孵化后选取雄性雏鸡进行42天饲养。随后采集回肠和盲肠食糜及黏膜样品（每组n=10）进行分析。在回肠中，NaCl、GOS和SB刺激降低了戊酸浓度（与NC组相比），PC组黏蛋白酶活性高于其他组。在盲肠中，NaCl、GOS和SB增加了对甲酚浓度（与NC组相比）。SB组组蛋白去乙酰化酶活性高于NC组。在回肠中，与NC和PC组相比，GOS上调VIL1/EEF2和GPD2表达，下调HSPD1/TUBA、LMNA/WDR1和AARS1表达。SB刺激增加了ACTB、GK2、GSS、PRDX3、UQCRFS1和ANGPT1L表达，降低了APOA1、TUBA/HSPD1、MVP、CKB和LMNA/WDR1表达（与两个对照组相比）。在盲肠中，与两个对照组相比，GOS上调TAGLN2、UQCRC2/PGK和EEF1A1表达，下调KRT18表达。SB组GANAB、ALDOA/GAPDH、HADHA/HNRNPM、HIST1H2B5L和EEF1A1表达升高，KRT18、ALDH9A1和EEF2表达降低。卵内刺激GOS和SB对肉鸡肠道微生物区系活性影响轻微，但对回肠和盲肠蛋白质组产生后期效应。两种化合物均诱导细胞骨架组织的细微变化，可能反映上皮完整性、吸收能力、代谢效率的提高及细胞应激的降低。
**研究背景与问题**
半乳寡糖（GOS）是由葡萄糖分子与2~20个半乳糖单元通过β(1→3)、β(1→4)或β(1→6)键连接而成的非消化性碳水化合物，主要由乳糖经β-半乳糖苷酶催化转半乳糖基化合成。作为益生元，GOS可选择性刺激双歧杆菌和乳酸菌生长，减少肠道有害化合物形成，促进短链脂肪酸（SCFA）产生，增加矿物质和维生素吸收并改善免疫力。丁酸钠（SB）是丁酸的固体钠盐，稳定性好、气味小，可作为饲料添加剂使用，具有改善养分消化率、刺激小肠绒毛发育、抑制盲肠病原菌等作用。卵内技术可实现早期营养干预和禽类健康程序化。前期研究表明，在孵育第12天进行GOS和SB的卵内注射对鸡孵化后的生长性能、肉品质、肠道微生物生态和肠道屏障功能具有长期效应，但其对肠道微生物区系活性及黏膜蛋白质表达的影响尚不清楚。GOS作为大分子需先经肠道微生物发酵，可能通过细菌代谢产物间接发挥作用；SB作为小分子可被发育中的鸡胚直接吸收。因此，本研究旨在确定卵内刺激GOS和SB对肉鸡回肠和盲肠肠道微生物区系活性、表观遗传事件及蛋白质表达谱的影响。
**研究方法**
实验基于Dunis?awska等（2024）已描述的试验，选用1,200枚Ross 308种鸡受精蛋，孵育第12天将1,068枚存活受精蛋随机分为四组（每组267枚）：阴性对照组（NC）、生理盐水注射阳性对照组（PC）、GOS组（3.5 mg/蛋）和SB组（0.6 mg/蛋）。第21天孵化后每组选取84只雄性雏鸡（共336只），每组7个重复栏，每栏12只，饲养42天。第42天每组选取10只鸡采集回肠和盲肠食糜及黏膜样品。研究人员测定了食糜pH和SCFA浓度（气相色谱）、细菌酶活性（β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、黏蛋白酶）、氨含量、酚类化合物（苯酚、对甲酚、吲哚）和胺类浓度、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性、全局DNA甲基化水平，并采用双向电泳（2-DE）结合LC-MS/MS鉴定差异表达蛋白质，使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质关联网络。
**研究结果**
**食糜pH与短链脂肪酸**：卵内处理未影响回肠和盲肠食糜pH，也未影响回肠中乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和异丁酸浓度。生理盐水、GOS和SB处理降低了回肠戊酸浓度（P<0.001），但显著对比仅见于NC vs. PC和PC vs. SB。盲肠中SCFA浓度不受卵内刺激影响。
**细菌酶活性**：盲肠中β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶和黏蛋白酶活性远高于回肠。PC组回肠黏蛋白酶活性显著高于其他组（P<0.05），但显著对比仅见于NC与PC之间。盲肠中卵内刺激对三种酶活性均无影响。
**胺类、氨与酚类化合物**：盲肠食糜中检测到7种胺，卵内刺激对其浓度均无影响，对氨、苯酚和吲哚浓度也无影响。卵内处理影响对甲酚浓度（P<0.001），NaCl、GOS和SB组均高于NC组，但显著对比仅见于NC与PC之间。SB组对甲酚浓度低于GOS组。
**表观遗传事件**：卵内处理对回肠黏膜HDAC活性无影响。盲肠中SB组HDAC活性高于NC组（P<0.05），PC和GOS组与NC组无显著差异。卵内刺激对回肠和盲肠黏膜全局DNA甲基化无影响。
**回肠黏膜蛋白质组**：分析700个蛋白质斑点，55个显示名义统计差异。卵内处理本身（独立于注射物质）引起25个蛋白质斑点一致表达变化（8个上调、17个下调），成功鉴定20个，代表20种不同蛋白质。其中ALDH9A1、CYB5A、IDH3A、MDH2、TUFM和VIL1/EEF2上调，AARS1、ACTG1、AKR7A2、ALDH9A1/PDIA3、ECHS1、ETFDH/PKLR、HSP90AA1、SCIN、TF、VCL和VIL1下调。生理盐水单独效应表现为11个蛋白质斑点差异表达（7个上调：ALDH9A1、FABP2、FABP2/COX5B、VDAC2、HADH、FH和MDH2；5个下调：ATP5B/PDIA6、ACTG1、TPI1、SCIN和VCL）。GOS单独效应包括5个蛋白质斑点变化：VIL1/EEF2和GPD2上调，LMNA/WDR1、AARS1和TUBA/HSPD1下调（与两个对照组相比）；次级效应包括9个斑点差异表达。SB单独效应包括10个蛋白质斑点，成功鉴定8个：ACTB、GK2和GSS表达升高，APOA1、TUBA/HSPD1、MVP、CKB和LMNA/WDR1表达降低（与两个对照组相比）；次级效应包括SH3BGRL上调和VDAC2下调（与PC组相比）。
**盲肠黏膜蛋白质组**：分析724个可重复斑点，47个显示名义差异表达。卵内处理本身引起14个蛋白质斑点一致变化（4个上调：cPAD3、TAGLN2、MDH2/LDHA、RPL12；9个下调：TPM1、KRT18/VIM/RPSA、SEC13、ACTN4、TXNDC5、DES、GSN、TPI1、LOC771545）。生理盐水单独效应表现为12个斑点差异表达（10个上调：LCP1、NHERF1/KRT7、PDIA3、CCT2/SELENBP1、LMNA、ALDOA/GAPDH、ALDOC、LDHB、UGDH、LOC771545；2个下调：MYL12B和RPLP0）。GOS单独效应包括6个斑点变化，成功鉴定4个：TAGLN2、UQCRC2/PGK和EEF1A1上调，KRT18下调；次级效应包括GAPDH上调和8个斑点下调。SB单独效应包括10个斑点，成功鉴定7个：GANAB、ALDOA/GAPDH、HADHA/HNRNPM、HIST1H2B5L和RPS3表达升高，KRT18和EEF2表达降低（与两个对照组相比）；次级效应包括CLIC4上调和8个斑点下调。
**讨论与结论**
讨论部分指出，卵内操作本身（独立于注射物质）对回肠和盲肠蛋白质组产生显著后期效应，表现为细胞骨架组织、能量代谢和细胞应激响应相关蛋白质表达改变。GOS和SB均下调回肠WDR1表达、上调SH3BGRL表达，提示细胞骨架动态调节和肠道屏障完整性维持。GOS组VIL1、SCIN和VCL proteoforms表达升高，提示肌动蛋白细胞骨架重塑及黏蛋白分泌相关。SB组CKB、MVP下调及GSS上调提示细胞应激降低和抗氧化能力增强，APOA1下调可能与肠道微生物组成改变或SCFA合成变化有关。盲肠中KRT18下调、TAGLN2上调提示黏膜结构成熟和屏障完整性改善，SB组CLIC4和GANAB上调分别与紧密连接完整性和黏蛋白成熟相关，HIST1H2B5L上调可能作为底物贡献于HDAC活性升高。GOS组UQCRC2上调和PGK2表达改变提示线粒体呼吸链效率提高和糖酵解活性增加，支持杂交代谢激活的概念。研究结论译为：以3.5 mg GOS和0.6 mg SB刺激胚胎发育可诱导肠道微生物区系活性的轻微变化，表现为回肠戊酸浓度降低和盲肠对甲酚浓度升高。卵内刺激GOS和SB可能对肉鸡回肠和盲肠蛋白质组产生后期效应。蛋白质表达变化提示两种生物活性化合物可能促进上皮完整性、吸收能力、代谢效率并减少细胞应激反应，这些效应在SB处理后更为明显。
