《Pharmacological Research》：RDP-modified extracellular vesicles from brain organoid-derived mesenchymal stem cells improve the behavior and pathology of 5×FAD mice
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阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，治疗选择仍然有限。胞外囊泡（EVs）提供了一种潜在的无细胞治疗途径，但全身给药后脑暴露有限仍是主要障碍。来源于人脑类器官的间充质干细胞样细胞（hBO-MSCs）可能提供一种替代性EV来源，其分子谱由神经培养环境塑
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，治疗选择仍然有限。胞外囊泡（EVs）提供了一种潜在的无细胞治疗途径，但全身给药后脑暴露有限仍是主要障碍。来源于人脑类器官的间充质干细胞样细胞（hBO-MSCs）可能提供一种替代性EV来源，其分子谱由神经培养环境塑造。本研究旨在生成RDP修饰的hBO-MSC-EVs，并评估其理化特征、急性安全性、脑相关生物分布以及在5×FAD小鼠AD模型中的治疗相关效应。从背侧前脑样人脑类器官中分离hBO-MSCs，并工程化使其表达RDP-Lamp2b-HA融合蛋白。通过形态学、颗粒测量、EV相关蛋白标志物及相对RDP-Lamp2b-HA丰度对EV制备物进行表征。在C57BL/6J小鼠中评估脑相关生物分布和急性安全性，而在5×FAD小鼠中评估治疗相关结局，小鼠接受PBS、未修饰hBO-MSC-EVs或hBO-MSC-RDP-EVs。采用行为学测试、海马Aβ组织病理学和探索性转录组谱分析评估反应。静脉给药后，RDP修饰与未修饰EVs相比伴有更高的脑相关荧光，在测试终点无明显的急性器官组织病理学证据或一致的全身促炎反应。在5×FAD小鼠中，hBO-MSC-RDP-EV治疗与选定行为学指标的改善相关，最一致地体现在Morris水迷宫（MWM）中，同时伴有组织学可检测的海马Aβ斑块负荷减少以及炎症和神经元相关转录本的变化。这些发现值得进一步开展临床前评估，将表面工程化hBO-MSC-EVs作为AD的候选无细胞治疗途径。完整EV的血脑屏障（BBB）转运、货物依赖机制、来源特异性优势及长期安全性仍未确立。
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，全球受累人数达数千万，随着人口老龄化其患病率预计将大幅上升。尽管靶向淀粉样蛋白β（Aβ）的单克隆抗体如lecanemab和donanemab拓展了治疗选择，但其临床获益有限，且治疗需综合考虑费用、适用条件及不良事件监测。这些局限性促使研究人员开发AD的补充治疗策略。间充质干细胞（MSCs）及其来源胞外囊泡（EVs）在临床前AD模型中已显示治疗活性，包括改善淀粉样病理、炎症及行为学表现。然而，细胞治疗转化仍受限于细胞存活率不稳定以及免疫相容性和安全性问题。越来越多证据表明，MSC生物活性的重要组成部分由旁分泌信号介导，包括EVs。因此EVs提供了潜在的无细胞途径，但其组成、制造质量及体内分布仍是转化应用的重要决定因素。值得注意的是，EVs的生物学特性和功能谱严格取决于其亲本细胞的细胞来源和微环境生态位。EV包裹的蛋白质和microRNAs的分子异质性和功能多样性受供体细胞组织谱系紧密调控。在中枢神经系统（CNS）中，组织特异性EVs通过介导神经营养因子的细胞间转移发挥关键神经保护和神经修复作用。例如，神经嵴来源周细胞分泌的EVs可有效缓解认知障碍并减轻AD相关病理损伤，而体细胞皮肤来源的EVs治疗效果甚微。这些发现凸显了神经谱系特异性细胞来源EVs对CNS疾病的潜在治疗相关性。人脑类器官（hBOs）可模拟人神经发育的某些方面，为研究分化提供三维背景。研究人员推测，从hBO培养物中分离的间充质干细胞样细胞可提供具有独特神经环境分子谱的EV来源。然而，静脉给药的EVs大量被外周器官截留，限制了脑暴露。尽管有创性脑室内（ICV）注射可绕过血脑屏障（BBB），但其临床可行性严格受限。一种29个氨基酸的狂犬病毒糖蛋白衍生肽（RDP）已被广泛用作CNS靶向配体。当与EV表面锚定蛋白溶酶体相关膜蛋白2b（Lamp2b）融合时，RDP基序介导与脑神经元和小胶质细胞上丰富表达的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7-nAChR）的特异性结合，从而使全身给药的EVs能够有效在脑中蓄积。在前期工作中，研究人员通过小分子引导的神经诱导从hiPSC来源3D拟胚体成功生成了背侧前脑样hBOs，并从中分离了原代MSCs。通过编码RDP-Lamp2b融合蛋白的rAAV-DJ载体对这些hBO-MSCs进行基因工程改造，获得了靶向EVs（hBO-MSC-RDP-EVs），其特征为良好的免疫相容性和全身注射后增强的脑蓄积。最后，研究人员探究了hBO-MSC-RDP-EVs给药对5×FAD小鼠行为表现、Aβ斑块动态及神经炎症转录组谱的影响。然而，这些工程化hBO-MSC-RDP-EVs在AD背景下的精确分子机制和全面体内治疗效力仍有待充分阐明。研究人员的发现旨在提供一种新型可静脉给药的无细胞治疗候选物，并为阿尔茨海默病的管理提供关键机制见解。
研究人员首先从健康供体外周血单核细胞重编程的hiPSCs出发，经小分子引导的神经诱导生成背侧前脑样人脑类器官，在分化第35天分离出具有MSC样表型的hBO-MSCs（表达CD73、CD90、CD105，不表达CD31、CD34、CD45，并具有三系分化能力）。通过rAAV-DJ载体将RDP-Lamp2b-HA融合蛋白导入hBO-MSCs，收集条件培养基并经试剂盒富集联合柱纯化获得hBO-MSC-RDP-EVs。采用透射电镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、Western blot及zeta电位测定对EVs进行理化表征，参照MISEV2023标准评估批间一致性。以小RNA测序比较hBO-MSC-EVs与hUC-MSC-EVs的miRNA谱差异。在6月龄C57BL/6J小鼠中，以DiR标记EVs进行离体器官荧光成像和脑组织HA免疫荧光定位，评估脑相关生物分布；通过血清细胞因子检测和主要器官H&E染色评估急性安全性。在2月龄5×FAD小鼠中，每周两次尾静脉注射PBS、hBO-MSC-EVs或hBO-MSC-RDP-EVs（200 μg EV蛋白/剂），连续8周，随后进行旷场实验（OFT）、新物体识别（NOR）、新位置识别（NLR）和Morris水迷宫（MWM）行为学测试，并采用Aβ1–42免疫荧光定量海马DG和CA1区斑块负荷，同时对海马组织进行RNA-seq和qRT-PCR分析。样本队列方面，C57BL/6J和5×FAD小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，行为学每组8只（雌雄各半），组织学和分子分析从每组选取3只（雌雄兼顾）。
研究结果显示：第一，人脑类器官的生成与表征——hiPSCs经诱导形成以背侧前脑样身份为主的hBOs，qRT-PCR检测到FOXG1、PAX6、EMX1等前脑标志物表达，免疫荧光显示第25天PAX6阳性、第35天PAX6+/GFAP+放射状胶质样细胞、NeuN+神经元及SOX2+祖细胞共存，支持神经分化表型但不确立完全区域纯度。第二，脑靶向工程化hBO-MSCs及hBO-MSC-RDP-EVs的生成与表征——hBO-MSCs呈成纤维细胞样形态，表达MSC标志物并具三系分化能力；转录组比较鉴定出5,510个差异表达基因，富集于神经元胞体、谷氨酸能突触、轴突导向及神经退行性通路；TEM显示囊泡结构，NTA显示粒径约100–150 nm，未修饰和RDP修饰EVs均表达CD9、CD81、CD63而不表达calnexin，RDP-Lamp2b-HA仅见于修饰组，三批制备物间CD9归一化RDP-Lamp2b-HA丰度无显著差异，粒径/蛋白比批间变异系数分别为1.33%和7.37%。第三，hBO-MSC-EVs与hUC-MSC-EVs的差异miRNA谱——小RNA测序鉴定313个差异表达miRNA（145个上调、168个下调），GO分析富集于突触组分和膜微区，KEGG富集于神经活性配体–受体相互作用和细胞因子–细胞因子受体相互作用；表中列出与神经疾病相关的DEmiRNAs如miR-138-5p、miR-1269a/b、miR-1228-5p等，但这些基于文献的注释仅提供假设。第四，RDP工程化EVs在小鼠中的脑相关分布——静脉给药12 h后血清IL-10、TNF-α、IL-6组间无显著差异，IL-1β低于检测限，两EV组TGF-β低于PBS组；主要器官H&E未见明显治疗相关异常；48 h后RDP修饰EVs脑相关荧光高于未修饰EVs，灌注脑切片中HA信号见于NeuN+神经元和Iba1+小胶质细胞区域，脑组织Western blot检测到弱RDP-Lamp2b-HA信号，作者将这些视为脑递送的支持性证据而非完整EV转胞吞的定量证明。第五，RDP工程化hBO-MSC-EVs改善5×FAD小鼠认知功能——OFT中RDP-EV组总路程、中央区路程、中央区停留时间、中央区进入次数及中央/总路程比总体高于PBS组；MWM获得期RDP-EV组逃避潜伏期后期接近WT小鼠，第6天探索试验中平台穿越次数和目标象限时间显著多于PBS组；NOR和NLR中RDP-EV组新物体/新位置偏好和辨别比显著高于PBS组；各组平均游泳速度和低速不动时间无显著差异。第六，hBO-MSC-RDP-EV治疗减少海马Aβ病理并伴随海马转录变化——DG区EV治疗组Aβ斑块沉积明显减少，RDP修饰组减少最显著，DG和CA1区各粒径类别斑块数、总斑块面积和Aβ阳性面积分数均降低，RDP-EV组总体斑块负荷显著低于未修饰EV组；Aβ/Iba1共染显示EV治疗组胞体增大的小胶质细胞可见减少；血清Aβ1–42在RDP-EV组显著低于PBS组；海马RNA-seq鉴定77个差异表达基因（59上调、18下调），Ifi204、Casp1、Nlrp3、Aif1、Itgam等炎症相关转录本下调，Lhx8、Eomes、Slc10a4、Glp1r、Lepr等神经发育/突触/神经保护相关转录本上调，qRT-PCR趋势与RNA-seq一致。
讨论部分指出，本研究将类器官来源EV与表面工程化相结合，观察到RDP修饰EVs脑相关蓄积增加及5×FAD小鼠行为学和组织病理学获益，但机制尚未完全阐明。作者承认亲脂性染料可能产生非特异性信号，荧光观察不能确立完整EV跨BBB转运；脑蓄积增加不一定产生成比例的治疗反应，RDP依赖的细胞相互作用或信号传导也可能参与其中。行为学改善以海马依赖的空间学习和记忆最为明显，游泳速度和低速不动的组间无差异降低了运动混杂的可能性，但细微感觉或运动缺陷不能排除。Aβ免疫染色减少不确立淀粉样清除增强或APP加工改变，循环Aβ1–42降低也不能独立指示脑清除。炎症和转录组发现具有关联性，bulk RNA-seq不能区分细胞内在转录调控与细胞组成变化，Aβ/Iba1共染不确立特定激活状态，TGF-β轻度降低的生物学意义不确定。hBO-MSCs与hUC-MSCs及其EVs的分子差异不确立来源依赖性治疗优越性，候选miRNA和Lhx8、Eomes等改变提供可检验假设但递送和靶基因调控未经证实。局限性包括组织学和分子分析样本量较小需独立重复、商业EV富集流程可能保留非EV成分、蛋白匹配剂量不确保等效颗粒暴露、缺乏完整EV跨BBB转胞吞的确切证据和肽特异性机制对照、缺乏治疗持久性纵向评估、长期安全性和制造可重复性有待评价，以及5×FAD模型主要再现加速淀粉样病理而不能充分捕捉tau病理或散发性AD复杂性。研究结论为：本研究提供临床前证据表明RDP工程化hBO-MSC-EVs与5×FAD小鼠脑蓄积增加及选定行为学和淀粉样相关结局改善相关，这些发现支持进一步研究类器官来源表面工程化EVs作为AD候选无细胞途径；在临床转化前，确立EV来源、RDP修饰和分子货物的具体贡献以及长期安全性和可重复制造至关重要。论文发表在《Pharmacological Research》。
