《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Empagliflozin Modulates Apoptosis and Autophagy Pathways in Lung Cancer Through Network Pharmacology and In Vitro Analysis
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肺癌仍是癌症相关死亡的主要病因，亟需新型治疗策略。恩格列净（Empagliflozin, EMPA）为钠-葡萄糖共转运体2（SGLT2）抑制剂，已显现抗肿瘤潜力，但其对肺癌中凋亡（apoptosis）-自噬（autophagy）互作的调控尚不清楚。研究人员通过
肺癌仍是癌症相关死亡的主要病因，亟需新型治疗策略。恩格列净（Empagliflozin, EMPA）为钠-葡萄糖共转运体2（SGLT2）抑制剂，已显现抗肿瘤潜力，但其对肺癌中凋亡（apoptosis）-自噬（autophagy）互作的调控尚不清楚。研究人员通过网络药理学（设定明确数据库关联评分截断值）与分子对接（以共结晶参比配体重对接验证），识别EMPA相关靶点；以MTT法评估EMPA、羟氯喹（Hydroxychloroquine, HCQ）单用及联用对人肺癌A549与HOP-92细胞毒性，结合指数（CI）与Bliss模型分析相互作用；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；RT-qPCR、cleaved caspase-3分析及Western blot检测凋亡与自噬标志物。网络分析获239个EMPA-肺癌重叠靶点，关联评分≥0.30后保留46个；对接显示EMPA可容纳于ANXA8、p62/SQSTM1 ZZ域及PPARγ口袋。EMPA降低两细胞系活力（A549更敏感）；联用HCQ显著降低IC50且在IC50水平呈协同。EMPA改变周期分布并促凋亡，伴BAX、CASP3上调及cleaved caspase-3激活；EMPA升高LC3-II而不累积p62，提示自噬活性增强，而HCQ组LC3-II与p62同累积、凋亡信号增强。结果表明EMPA具抗增殖与促凋亡作用并调控自噬，溶酶体降解抑制可增敏其细胞毒与促凋亡效应，支持该联用策略进一步研究。
研究背景与立项依据
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC，non-small cell lung cancer）占比约85%。尽管靶向治疗与免疫治疗取得进展，耐药与疾病进展仍限制长期疗效。凋亡（apoptosis，程序性细胞死亡）与自噬（autophagy，依赖溶酶体的组分降解回收过程）在肿瘤细胞命运决定中交织复杂：治疗诱导的自噬常作为适应性能量稳态机制保护癌细胞，而阻断自噬降解可增敏凋亡。恩格列净（Empagliflozin, EMPA）是临床成熟的钠-葡萄糖共转运体2（SGLT2，sodium-glucose cotransporter 2）抑制剂，除降糖外，临床前证据提示其可扰动肿瘤代谢、增殖与应激信号，但其在肺癌中如何协调凋亡-自噬互作仍不明确。基于此，研究人员开展“计算预测+体外验证”的整合研究，明确EMPA单用及联用自噬抑制剂羟氯喹（HCQ，hydroxychloroquine，溶酶体干扰剂）的抗癌机制。
主要技术方法概览
研究人员采用五库靶点挖掘与UniProt标准化构建EMPA-肺癌交集，以Open Targets关联评分≥0.30过滤，STRING与Cytoscape做蛋白互作（PPI，protein-protein interaction）及枢纽靶点筛选，ShinyGO做GO/KEGG富集；分子对接以PyRx与AutoDock Vina进行，并用EGFR-厄洛替尼晶体姿态重对接验证流程可靠性。体外以人肺癌A549（腺癌）与HOP-92（NSCLC）细胞为模型（来源于VACSERA细胞库），MTT测活力与IC50 ，Loewe组合指数（CI，combination index）与Bliss独立性判定协同；流式细胞术做细胞周期（PI染色）与Annexin V/PI凋亡分型及cleaved caspase-3内染；RT-qPCR测BAX、CASP3、P62（SQSTM1）转录，Western blot看LC3-II与p62蛋白。
网络药理学分析结果
研究人员从多库获得EMPA预测靶点246个、肺癌靶点经评分过滤后846个，交集239个，评分过滤后保留46个重叠靶点。PPI与拓扑分析提炼出GAPDH、IL1B、EGFR、HSP90AA1、NFKB1、MTOR等枢纽靶点；富集指向癌症相关通路、化学刺激应答与代谢相关过程。分子对接显示EMPA可定位于ANXA8表面沟槽、p62/SQSTM1的ZZ锌指域界面，以及PPARγ配体口袋（Ω-pocket），结合能约?7.0至?7.6 kcal/mol；流程验证用厄洛替尼重对接EGFR晶体位，重原子RMSD 1.30±0.02 ?，证明对接仅作几何可行性估计而非直接结合证据。
细胞毒性与药物协同
MTT显示EMPA与HCQ均浓度依赖抑活力，A549较HOP-92更敏感。单用IC50 ：A549中EMPA 52.9、HCQ 58.5 μg/mL；HOP-92中EMPA 81.6、HCQ 109.8 μg/mL。联用后IC50 降至11.3（A549）与28.9（HOP-92）μg/mL。CI50 分别为0.406与0.618（均<1，协同），剂量递减指数（DRI，dose-reduction index）显示EMPA可降约4.7倍与2.8倍、HCQ降约5.2倍与3.8倍。Bliss分析表明协同主要出现在低-中浓度，高浓度趋近或低于独立叠加预期。
细胞周期与凋亡表型
流式周期分析：EMPA使A549积聚G0/G1（58%→72%）伴S期缩减，呈G1阻滞；HOP-92则G0/G1与S略升、G2/M剧降（17.3%→2.8%），归为G1/S相关阻滞。Annexin V/PI显示EMPA总死亡由约3%升至23%（A549）与19%（HOP-92），以晚期凋亡为主；cleaved caspase-3阳性率由基线约1.4%–2%升至21.6%（A549）与19.5%（HOP-92），联用进一步升至33.6%与27.6%。
凋亡与自噬标志物
RT-qPCR：EMPA上调CASP3与BAX（A549约2.35/2.20倍，HOP-92约2.10/1.95倍），p62转录不变；HCQ单用轻度升凋亡基因并显著升p62；联用最强（CASP3最高3.45倍）。Western blot：EMPA单用升LC3-II但不堆p62，符合自噬流增强；HCQ及联用则LC3-II与p62双高，提示溶酶体降解受阻、自噬通量阻塞并放大凋亡信号。
讨论与结论翻译
讨论指出，EMPA的抗肺癌效应不依赖单一靶点，而是通过代谢-应激-凋亡/自噬网络发挥作用；治疗诱导的自噬在肺癌细胞中具细胞保护性，HCQ阻断溶酶体降解后解除该保护，使EMPA介导的线粒体/执行者 caspase 激活更有效。网络药理学的多靶点预测与体外标志印证相互支撑，但对接分数不宜直接解读为亲和力。
结论：EMPA在肺癌细胞中发挥抗增殖与促凋亡作用，同时调控自噬活性；HCQ抑制溶酶体自噬降解可增强EMPA细胞毒与凋亡效应，两药在IC50 水平显示协同。该结果支持将EMPA联合自噬-溶酶体阻断作为肺癌候选策略，并需后续在动物模型与临床前系统中验证。
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把全文改写成期刊审稿意见 提炼实验设计的方法学局限与改进点 把全文改写成期刊审稿意见 提炼实验设计的方法学局限与改进点
