一种通过益生菌递送的AIEgen/天然药物生物混合系统，用于针对HMGB2的前列腺癌治疗

《Nano Today》：A probiotic-delivered AIEgen/natural medicine biohybrid system for prostate cancer therapy via HMGB2 targeting

摘要

前列腺癌仍然是一个重要的临床挑战，现有的治疗方法受到严重毒性和耐药性的限制。芹菜素（Celastrol）是一种天然的三萜类化合物，显示出强烈的抗癌活性，但由于其溶解度低和剂量限制性的毒性，其临床应用受到限制。聚集诱导发光剂（AIEgens）在光疗方面具有很大的潜力，但肿瘤靶向性和耐药性限制了其效果。为了解决这些问题，我们开发了一种由益生菌递送的生物混合平台LGG@BITT-Cel-Poly，该平台同时递送芹菜素和AIEgen BITT。该系统是通过层层组装将LGG与壳聚糖（chitosan）、芹菜素和BITT结合而成的。“益生菌-药物-光敏剂”平台利用了LGG天然的肿瘤趋向性实现靶向积累。在体外实验中，LGG@BITT-Cel-Poly显著增强了细胞的吸收和活性氧（ROS）的生成。在异种移植前列腺癌模型中，该系统结合660纳米激光照射，通过光疗和化疗的协同作用实现了显著的肿瘤抑制效果，在短期观察期间未发现器官出现明显的组织病理学异常。基于活性的蛋白质分析和LC-MS/MS检测发现HMGB2是芹菜素的一个新直接靶点。分子对接和表面等离子体共振（SPR）证实了这种结合；敲低HMGB2的表达与芹菜素相似地抑制了肿瘤增殖，表明HMGB2可能参与了抗增殖反应。值得注意的是，分子对接表明Cys-106可能是相互作用位点；其共价修饰仍有待实验验证。这种生物混合策略克服了递送障碍，整合了多种疗法和主动靶向机制，并揭示了一个新的靶点，为精准治疗前列腺癌提供了有前景的方法。

引言

前列腺癌是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因[1]、[2]。目前的标准治疗策略，包括根治性前列腺切除术、放疗和雄激素剥夺疗法，在晚期疾病中往往由于耐药性的出现和剂量限制性的全身毒性而失败[3]、[4]、[5]。因此，迫切需要能够克服耐药机制同时最小化脱靶效应的多模式治疗方案[6]、[7]。天然产物长期以来一直是抗癌药物发现的重要来源[8]。其中，芹菜素是从Tripterygium wilfordii中提取的一种五环三萜类化合物，因其通过蛋白酶体抑制、热休克蛋白调节和诱导凋亡等多种机制而在多种癌症类型中表现出强大的抗肿瘤活性而受到广泛关注[9]。然而，由于其极低的水溶性、快速的全身清除和剂量限制性的器官毒性，芹菜素的临床应用受到严重限制[10]。在光疗领域，聚集诱导发光剂（AIEgens）的研究取得了进展，这类光敏剂在聚集状态下会发出强烈光信号，从而实现高效的光动力和光热效应[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。然而，AIEgens的治疗应用同样受到肿瘤选择性不足、细胞内递送效率低下以及肿瘤细胞对单模光疗的固有耐药性的影响[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。这些限制凸显了迫切需要智能递送系统的需求，这类系统能够同时溶解并靶向自然化疗药物和光疗剂到肿瘤部位[24]、[25]。

芹菜素发挥抗癌作用的机制部分归因于其作为目标蛋白质中亲核半胱氨酸残基的共价修饰剂的能力，从而导致功能抑制[26]。然而，它在前列腺癌细胞中的直接靶点尚未完全明确，这限制了对作用机制的深入理解和基于生物标志物的应用[27]、[28]。确定具体的分子靶点对于合理开发基于芹菜素的疗法至关重要[9]、[30]。高移动性组盒2（HMGB2）是一种非组蛋白染色质相关蛋白，能结合扭曲的DNA结构并调节转录、基因组稳定性和细胞增殖。HMGB2在前列腺癌和其他实体瘤中过度表达，促进肿瘤增殖、上皮-间质转化和转移，其表达升高与患者预后不良相关[31]、[32]。尽管HMGB2在前列腺癌治疗中显示出潜在的治疗作用，但尚未被探索为芹菜素的直接靶点。如果能够证明并利用其作为靶点，那么将共价药物与肿瘤过表达蛋白结合将带来有吸引力的治疗机会。

基于活细菌的递送平台最近作为一种变革性方法出现，旨在克服传统纳米药物的递送障碍[33]、[34]、[35]。某些益生菌菌株，尤其是鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，简称LGG），在全身给药后具有选择性地定植和在缺氧、免疫抑制的肿瘤微环境中增殖的天然能力[36]、[37]。这种天然的肿瘤趋向性，加上在检查器官中未出现明显的短期组织病理学异常以及表面功能化的能力，使LGG成为一种有效的肿瘤靶向药物递送载体[38]。层层组装技术提供了一种温和且多功能的方法，可以在不影响细菌存活性和肿瘤靶向能力的情况下为其包裹治疗负荷[39]、[40]。利用这一策略，将化疗天然产物和AIEgen光敏剂整合到同一益生菌底盘上，理论上可以实现具有主动肿瘤靶向作用的协同化化学光疗，同时递送具有不同抗癌机制的药剂，并减轻游离药物的全身毒性。迄今为止，尚未在前列腺癌中实现这种由益生菌介导的生物混合平台用于芹菜素和AIEgen的联合递送[24]、[41]。

在这项研究中，我们开发了一种由益生菌递送的生物混合系统LGG@BITT-Cel-Poly（简称Poly），旨在克服芹菜素和AIEgen的递送障碍，并同时揭示芹菜素在前列腺癌中的新直接靶点。该平台通过层层组装将LGG与壳聚糖、芹菜素和660纳米激光激发剂BITT结合，形成了一个“益生菌-药物-光敏剂”载体，利用LGG的天然肿瘤趋向性实现靶向积累。在体外实验中，LGG@BITT-Cel-Poly显著增强了细胞的吸收和细胞内活性氧的生成。在PC3异种移植前列腺癌模型中，结合660纳米激光照射，该系统通过光动力学/光热疗法和芹菜素介导的化疗实现了显著的肿瘤抑制效果，在观察期间主要器官的组织学检查中未发现明显的组织病理学异常。通过基于活性的蛋白质分析和LC-MS/MS，我们确定HMGB2是芹菜素的新直接靶点。分子对接和表面等离子体共振验证了这种结合，并进一步证明芹菜素可能通过共价修饰HMGB2的Cys-106位点来稳定这种相互作用。重要的是，敲低HMGB2的表达能够复制芹菜素的抗增殖效果，表明HMGB2靶向是芹菜素抗肿瘤作用的关键机制。这种生物混合策略同时解决了递送障碍，整合了多种疗法和主动肿瘤靶向，并发现了一个以前未被认识的治疗靶点，为精准和协同治疗前列腺癌提供了有前景的方法。

章节片段

结果与讨论

前列腺癌具有深刻的分子和组织的异质性，单药治疗方案难以实现持久的肿瘤控制。为了解决这一挑战，我们构建了一种活的生物混合递送平台LGG@BITT-Cel-Poly，通过肿瘤趋向性的益生菌鼠李糖乳杆菌 GG（LGG）同时递送聚集诱导发光剂BITT和天然五环三萜类化合物芹菜素。

结论

总结来说，我们通过层层组装将益生菌鼠李糖乳杆菌GG与壳聚糖、芹菜素和近红外AIEgen BITT结合，开发了一种活的生物混合系统LGG@BITT-Cel-Poly。该设计利用了LGG天然的肿瘤趋向性实现肿瘤内的靶向积累，同时显著增强了细胞对药物的吸收，从而克服了长期以来限制芹菜素和AIEgen溶解度和渗透性的障碍。在660纳米激光照射下，该平台……

材料

试剂和材料的来源如下：芹菜素（Cel）和重组人HMGB2蛋白来自MedChemExpress（中国上海）；针对HMGB2的siRNAs以及抗HMGB2和GAPDH的抗体来自Sangon（中国上海）；FBS、DMEM/F12和青霉素-链霉素来自Corning（美国纽约）；TAMRA叠氮化物、NaVc、CuSO?和生物素叠氮化物来自Sigma（美国圣路易斯）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和活性氧检测试剂盒来自Beyotime Biotechnology（中国上海）……

CRediT作者贡献声明

Fan Wen：数据整理。Mingming Wang：数据整理。Shujie Zhang：数据整理。Yunlong Liu：正式分析。Xuemei Dong：数据整理。Rendy Hosea：正式分析。Fengfei Zhao：数据整理。Yujun Zhang：软件开发。Ben Zhong Tang：监督。Xinghua Yu：监督。Fei Sun：资金争取。

动物实验

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。

本研究得到了浙江大学实验动物护理和使用委员会的批准。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省科学技术厅（项目编号WKJ-ZJ-2505，资助对象F.S）和宁夏回族自治区重点研发计划（项目编号2026BEG02028，资助对象F.S）的支持。

Fan Wen | Mingming Wang | Shujie Zhang | Yunlong Liu | Xuemei Dong | Rendy Hosea | Fengfei Zhao | Yujun Zhang | Ben Zhong Tang | Xinghua Yu | Fei Sun浙江大学医学院泌尿与男科系，杭州，浙江310016，中国