一种经过改造的益生菌酵母能够将细胞外的三磷酸腺苷（ATP）转化为腺苷，从而缓解实验性结肠炎的症状

《Microbiological Research》：An engineered probiotic yeast converts extracellular ATP into adenosine to alleviate experimental colitis

　　**摘要**

炎症性肠病（IBD）是一种慢性复发性肠道疾病，其特征是黏膜炎症、上皮屏障破坏和肠道微生物群失衡。在发炎的肠道组织中，过量的细胞外ATP（eATP）积累并通过嘌呤能信号传导放大免疫激活，而由细胞外核苷酸代谢产生的腺苷则具有免疫调节作用。在这里，我们通过CRISPR技术改造了益生菌酿酒酵母 Saccharomyces boulardii，使其能够感知eATP，并通过一种由apyrase和5′-核苷酸酶组成的双酶途径将其转化为腺苷。这种工程菌株表现出对ATP的响应性，并能高效地将eATP转化为腺苷，从而在炎症环境中调节细胞外核苷酸代谢。口服该菌株显著缓解了急性硫酸葡聚糖（DSS）诱导的结肠炎的症状，在重复性DSS模型中也显示出有益效果，改善了屏障相关的上皮特性，减少了促炎细胞因子的产生，并促进了黏膜的恢复。综合微生物组和转录组分析进一步显示，肠道微生物群结构部分恢复，预测的微生物嘌呤相关途径部分恢复正常，黏膜T细胞的激活也有所减弱。这些发现表明，工程化的Saccharomyces boulardii可以调节炎症肠道中的细胞外嘌呤代谢，为调控肠道炎症提供了一种微生物策略。

**引言**

炎症性肠病（IBD）是一种慢性免疫介导的胃肠道疾病，全球有超过680万人受到影响，且发病率持续上升（GBD 2017 Inflammatory Bowel Disease Collaborators 2020）。目前的疗法包括皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂，可以在一些患者中诱导缓解，但难以实现持久的疗效。大约30-40%的患者对生物制剂没有初步反应，而最初有反应的患者中也有近一半最终会失去治疗效果（Roda et al., 2016, Singh et al., 2018）。IBD的发病机制涉及黏膜免疫激活、上皮屏障功能障碍和肠道微生物群失衡之间的相互作用，使得肠道微环境成为局部微生物干预的有力目标（Neurath et al., 2025, Shan et al., 2022）。尽管益生菌已被探索作为调节肠道微环境的替代策略，但在IBD中的临床效果有限且不稳定，只有部分患者能够实现缓解（Chen et al., 2021, Murali and Mansell, 2024）。这些局限性突显了迫切需要更安全、更精确的疗法来局部调节肠道炎症。

在现有的益生菌候选者中，酿酒酵母 Saccharomyces boulardii因其在多种胃肠道疾病中的临床应用和有益效果而受到特别关注。与细菌益生菌相比，S. boulardii对胃肠道环境具有很强的耐受性，包括消化酶、胆盐和pH值变化，并且在抗生素治疗期间仍能存活（Pais et al., 2020）。作为一种酵母，S. boulardii在生态行为上也与细菌益生菌不同，它可以在肠道中发挥短暂的功能活性，而不会稳定定植或严重破坏原有的肠道细菌群落（Kabbani et al., 2017, Kelesidis and Pothoulakis, 2012）。这些特性加上其已建立的临床安全性，使得S. boulardii成为基于益生菌的疗法的理想候选者。然而，野生型益生菌通常具有广泛且依赖环境的作用机制，无法主动根据肠道炎症信号调整其功能输出。这一局限性促使人们开发基于临床相关宿主的工程化益生菌。

工程化益生菌成为增强传统微生物干预在IBD中治疗效果的有前景的方法。通过在肠道腔内直接产生生物活性分子，工程微生物可以加强局部免疫调节，扩大益生菌干预的治疗潜力（Li et al., 2024, Wu et al., 2024a, Wu et al., 2024b）。最近在IBD工程化益生菌方面的进展强调了靶向递送、炎症响应性调节、上皮屏障修复和肠道微生物群调节的重要性（Huang et al., 2024）。然而，现有设计仍存在一些局限性：一些系统依赖于非临床微生物宿主，而另一些则提供持续性的治疗效果而不适应局部炎症信号。此外，许多方法仅针对单一炎症途径，而IBD涉及免疫失调、上皮损伤和肠道微生物失衡的复杂相互作用（Chang, 2020）。因此，需要能够响应炎症信号并调节宿主-微生物代谢相互作用的临床相关工程化益生菌。

细胞外三磷酸腺苷（eATP）是一种在炎症过程中由受损或受压细胞释放的危险相关分子信号。在发炎的肠道组织中检测到eATP水平升高，它可以通过免疫细胞和上皮细胞上的嘌呤能受体放大免疫反应（Di Virgilio et al., 2020, Huang et al., 2021）。在IBD中，过度的eATP信号传导会促进促炎细胞因子的产生并加剧黏膜免疫激活。在生理条件下，细胞外核苷酸通过ectonucleotidases（如CD39和CD73）逐步水解生成腺苷，这是一种抑制炎症和支持组织修复的免疫调节代谢物（Antonioli et al., 2022, Eltzschig et al., 2012, Santana et al., 2024, Stepanova and Aherne, 2024）。因此，细胞外核苷酸代谢不仅仅是去除炎症ATP，还重塑了危险信号与免疫调节代谢物之间的平衡。因此，eATP-腺苷平衡是肠道炎症中细胞外嘌呤代谢的重要轴心。

最近的研究表明，工程微生物可以用于靶向肠道炎症中的细胞外核苷酸代谢。例如，一种工程化的酿酒酵母系统被开发出来用于感知eATP并通过可诱导的ATP降解来减轻结肠炎（Scott et al., 2021）。这些发现证明了使用微生物系统响应炎症核苷酸信号的可行性，但将eATP直接转化为腺苷在临床使用的益生菌中的应用研究较少。在这里，我们通过CRISPR技术改造了益生菌酿酒酵母 Saccharomyces boulardii，使其能够感知eATP并通过apyrase/5′-核苷酸酶途径将其转化为腺苷。这种设计将炎症核苷酸感知与肠道中的细胞外嘌呤代谢调节结合起来。口服该工程菌株可缓解实验性结肠炎，改善上皮组织学和紧密连接相关指标，并有助于部分恢复微生物和免疫稳态。

**实验试剂**

Nourseothricin、hygromycin B、kanamycin、ampicillin、geneticin和ATP溶液（10 mmol/L）从Solarbio（北京，中国）购买。α-Factor交配信息素从Macklin（上海，中国）购买。葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、NaCl、DO Supplement–His/–Leu/–Ura、尿嘧啶、亮氨酸和组氨酸从Coolaber（北京，中国）购买。Cas9-NAT、gRNA-ura-HYB、gRNA-leu-HYB和gRNA-his-HYB质粒最初由Yong-Su Jin实验室构建。

**构建遗传操作性S. boulardii底盘**

野生型S. boulardii MYA-796是一种缺乏选择性营养缺陷标记的二倍体菌株，这限制了其用于迭代基因工程的能力。因此，我们生成了适合CRISPR-Cas9操作的無疤痕营养缺陷突变体。采用之前用于多营养缺陷工业酿酒酵母菌株的策略（Zhang et al., 2014），我们在目标基因的PAM区域引入了一个TAA终止密码子。这种设计在破坏基因功能的同时防止了Cas9的重复切割。

**讨论**

能够感知细胞外炎症信号的工程微生物为局部治疗肠道炎症提供了有前途的策略（Murali and Mansell, 2024, Zhang et al., 2023, Zou et al., 2024）。先前的eATP响应性微生物系统表明，与疾病相关的核苷酸信号可以用于调节炎症肠道环境中的治疗效果（Scott et al., 2021）。基于这一概念，我们改造了临床使用的益生菌酵母S。

**结论**

一种能够将eATP转化为腺苷的工程化Saccharomyces boulardii菌株可以缓解实验性结肠炎。这种效果伴随着上皮组织学的改善和紧密连接相关指标的改善，以及黏膜免疫激活的减少和肠道微生物平衡的部分恢复。这些发现支持工程化益生菌通过转化细胞外核苷酸来调节eATP-腺苷平衡的微生物策略。

**缩写**

AB–PAS：Alcian blue–periodic acid–Schiff
ALT：丙氨酸氨基转移酶
ANOVA：方差分析
ASV：扩增子序列变异
AST：天冬氨酸氨基转移酶
ATP：三磷酸腺苷
CFU：菌落形成单位
DAI：疾病活动指数
DSS：硫酸葡聚糖
eATP：细胞外三磷酸腺苷
ELISA：酶联免疫吸附测定
FDR：假发现率
FPKM：每百万映射读数中的片段数
GPCR：G蛋白偶联受体
H&E：苏木精和伊红

**伦理批准和参与同意**

本研究得到了南方医科大学南方医院伦理委员会的批准。该研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的建议。方案获得了南方医院动物实验伦理委员会的批准。

**资助**

本研究得到了国家自然科学基金（82222011、82170566和82570649）、国家重点研发计划（2024YFA1307102）以及广东省科学技术项目（2017B030314037）的支持。

**作者贡献声明**

张明欣：调查、正式分析
刘慧叶：写作-初稿、验证、方法学、调查、正式分析
邓青云：可视化、验证
吴伟珍：软件、方法学
马荣伟：软件、正式分析
李小芳：可视化、数据管理
黄冰：写作-审稿与编辑、监督、资金获取、概念化
白兰：写作-审稿与编辑、监督、项目管理

**利益冲突声明**

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**

作者感谢南方医科大学南方医院的所有专业人士的时间和参与。

**利益冲突声明**

作者声明没有利益冲突。