KRASG12R和KRASG12D的分子信号转导特征……

《Cancer Research》：Molecular signaling profile of KRASG12R and KRASG12D ...

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摘要

临床级别的RAS抑制剂提出了一个未解决的问题，即KRAS等位基因是否对适应性抵抗机制施加了限制，这些限制是否可以被利用于治疗。我们使用了多选择性RAS(ON)抑制剂daraxonrasib (RMC-6236)，比较了KRASG12D和KRASG12R之间的抵抗机制，这两种突变体的RAS网络动态有着根本性的不同。daraxonrasib主要通过空间阻挠效应蛋白的结合来抑制突变型KRAS，而对野生型RAS (RASWT)的抑制作用仅约为20%。KRASG12R的特点是它无法重新激活RASWT，而耐daraxonrasib的KRASG12R胰腺导管腺癌（PDAC）细胞则利用EGFR/RASWT-GTP信号通路作为主要的适应途径。相比之下，KRASG12D的抵抗机制是通过保留KRASG12D-GTP信号通路实现的，同时伴随着循环磷脂A（CypA）蛋白质的减少，而CypA是daraxonrasib发挥作用所必需的结合伴侣。从依赖KRASG12R转变为依赖EGFR/RASWT使得这些细胞对trametinib敏感。临床验证显示，一名携带KRASG12R突变的PDAC患者在接受daraxonrasib治疗10个月后病情进展，其肿瘤内检测到了EGFR/RASWT的激活，且快速3D生物打印的患者来源肿瘤模型预测其对该联合疗法敏感。尽管疾病进展迅速，并且对之前的两种治疗方案均无反应，但第六线的trametinib联合疗法仍实现了大约5个月的疾病控制，这名患者的总生存期达到了40个月，远远超过了转移性PDAC的8到12个月中位生存期。总体而言，这些数据建立了一个框架，即等位基因特异性的RAS网络拓扑结构决定了适应性抵抗的格局，从而能够合理选择在转移性PDAC中具有实际临床效益的靶向疗法。

意义：daraxonrasib的耐药性通过等位基因特异性途径产生，在KRASG12D中CypA下调，在KRASG12R癌细胞中则依赖EGFR/RASWT，这为对RAS抑制剂产生耐药性的患者提供了基于机制的治疗策略。图形摘要

引言

大约90%到95%的胰腺导管腺癌（PDAC）病例在密码子12处携带激活型的KRAS突变，最常见的突变类型是G12D（35%）、G12V（20%–30%）和G12R（10%–20%；参考文献1）。daraxonrasib (RMC-6236)是一种多选择性RAS(ON)抑制剂，它通过依赖循环磷脂A（CypA）的三复合体机制靶向活性GTP结合的RAS（2）。与仅针对KRASG12C的等位基因特异性抑制剂（3）不同，daraxonrasib对密码子12的各种突变体（G12D、G12V、G12R、G12A、G12S）都有效，可能通过同时抑制突变型RAS（RASMUT）和野生型RAS（RASWT）来实现更持久的抑制效果（参考文献4）。I期试验显示其安全性良好，二线治疗的中位无进展生存期（PFS）为7.6个月（5），III期试验表明其效果显著优于标准化疗，预计很快将获得FDA批准（6）。然而，正如所有靶向疗法一样，获得性耐药性是不可避免的，尤其是在缺乏针对晚期治疗的前瞻性、基于证据的框架的情况下（7），治疗策略尤其具有挑战性。转化模型可以提供对耐药机制的见解，但其开发时间往往超过指导治疗的临床窗口期（8）。对RAS抑制剂的耐药性是异质性的，并且通常是多克隆的；大约一半对KRASG12C抑制剂产生耐药性的患者没有可识别的共突变（9, 10），这表明存在非遗传机制、转录重编程、谱系可塑性和适应性信号通路重新激活等现象，这些因素通过测序不易检测到，但在功能上却起着决定性作用。上皮细胞向间充质细胞的转变和组织学转化可以通过独立于KRAS的间充质细胞状态来推动耐药性（11），这突显了蛋白质表达和活性水平变化作为治疗逃逸的关键因素。突变型KRAS（KRASMUT）的致癌效应不仅取决于其自身的活性，还取决于它如何通过等位基因特异性调控鸟苷核苷酸交换因子（GEFs）和GTP酶激活蛋白（GAP；参考文献（12–16）来重塑更广泛的RAS网络，从而差异性地调节RASWT的同源蛋白并形成超越突变等位基因本身的网络拓扑结构（16, 17）。这种KRASMUT与RASWT之间的配比关系是动态的：例如治疗性KRASMUT抑制等干扰可以实时重新分配GEF/GAP的活性并改变RASWT的激活状态（17）。因此，我们应用系统生物学框架以高时间分辨率研究等位基因特异性的RAS网络行为，揭示了KRASMUT与RASWT之间的配比关系如何调控适应性信号通路并塑造耐药性，从而建立了能够在没有新的基因组改变的情况下预测耐药性拓扑结构的模型系统。我们报告了一名携带KRASG12R突变的PDAC患者，该患者最初对daraxonrasib有很好的反应，之后出现了耐药性，这为了解RAS靶向治疗的适应性提供了宝贵的窗口。利用KRASG12D和KRASG12R的临床前模型，我们找到了G12R对daraxonrasib高度敏感的机制基础，并确定了由G12R向RASWT（HRAS和NRAS）表达和信号通路转变所驱动的耐药机制。对该患者切除肿瘤的生化分析确认了主要的RASWT信号通路，这与我们的临床前模型一致，并使用3D打印的肿瘤模型和患者来源的器官型培养物验证了MEK抑制作为合理的补救策略的有效性。跨适应症的trametinib联合疗法在放射学和生物标志物方面都显示出了疾病控制的证据。对KRASMUT与RASWT活性的配比分析为这种反应提供了机制上的解释，支持在获得性RAS抑制剂耐药性研究中进行此类分析的合理性。

患者和治疗

根据《赫尔辛基宣言》从参与本研究的患者处获得了书面知情同意。该研究方案已经获得了威斯康星医学院伦理审查委员会[MCW; PRO00045718 (NCT05630989), PRO00044894 (NCT05802069), 和 PRO00033119]的审查和批准。所有程序均符合公认的伦理准则和规范人类受试者研究的机构政策。

细胞系模型和培养

细胞系由Synthego公司为McFall实验室生成，具体方法如先前研究所述。细胞在含有10% FBS、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和L-谷氨酰胺（2 mmol/L）的DMEM培养基中培养，培养条件为37°C和5% CO2。所有细胞系均经过支原体检测（使用MycoAlert检测试剂盒），并在获取后的11代内使用以保持细胞完整性。本研究中使用的所有PANC-1细胞系及其他细胞系均直接从来源机构或商业供应商（ATCC、DSMZ、日本研究生物资源细胞库、Riken细胞库、Horizon Discovery）获得，这些机构在分发前都会进行短串联重复序列分析以验证细胞系的真实性。通过CRISPR介导的敲入技术从这些经过认证的PANC-1细胞系生成了同源的KRASMUT衍生物，并通过Sanger测序进行了验证。

结直肠癌细胞系库培养

SW48细胞（RRID:CVCL_LC92）及其同源细胞在Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基中培养，培养基中含有FBS（10%）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和L-谷氨酰胺（2 mmol/L）。SW403（RRID:CVCL_0545）细胞在L-15培养基中培养，培养基成分相同。LS-180细胞在Eagle最低必需培养基中培养。LoVo（RRID:CVCL_0399）细胞在F12-K培养基中培养。HCT116（RRID:CVCL_E4IN）细胞在McCoy 5A培养基中培养。HCT-15（RRID:CVCL_0292）细胞在RPMI 1640培养基中培养。CaCo2细胞在DMEM培养基中培养。所有细胞均在指定的培养基中培养，并在37°C和5% CO2条件下培养（除非在L15培养基中）。SW48细胞从Horizon Discovery获得。SW403、HCT116、HCT-15、CaCo2、SW48和LoVo细胞从ATCC获得。所有细胞系均经过支原体检测，并在获取后的11代内使用以确保细胞完整性并减少长期传代可能导致的表型漂移。

增殖测定的方法

将5,000个细胞接种到96孔板中的每个孔中，使用完全培养基。细胞附着后（24小时）开始治疗。在适当的时间点，通过MTT测定细胞活力；向每个孔中加入5 mg/mL的DTT（二硫苏糖醇）MTT溶液（放在磷酸盐缓冲盐水PBS中），然后在37°C下孵育2小时。结晶的formazan沉淀物溶解在100 μL的二甲基亚砜中，并使用Tecan Infinite 200 PRO Multimode Microplate Reader（RRID:SCR_020543）在590 nm波长下测量吸光度。每个处理重复三次，每个处理在八个重复孔中进行。

siRNA敲低

将细胞接种到含有siRNA和Lipofectamine RNAiMAX（13778150, Thermo Fisher Scientific）的粘附培养板上，siRNA的浓度为每10,000个细胞10 pmol，使用Opti-MEM减少培养基（按照制造商的指示）。使用的siRNA包括KRAS siRNA（S120703）、HRAS siRNA（S807, Thermo Fisher Scientific）、NRAS siRNA（S55, Thermo Fisher Scientific）以及非靶向的siRNA（AM4611, Thermo Fisher Scientific）。siRNA检测是由Thermo Fisher Scientific开发的专有检测方法，所有相关信息都可以通过检测ID获得。

Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（1862301, Thermo Fisher Scientific）生成细胞裂解液，并在冰上孵育1小时，期间每隔5分钟进行短暂涡旋。使用Pierce蛋白检测方法（Thermo Fisher Scientific）测定总蛋白浓度。蛋白质样品通过12% SDS–聚丙烯酰胺凝胶或4%至18%梯度凝胶进行电泳，然后使用Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad Laboratories, RRID:SCR_023156）在25 V电压下转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，电泳时间为30分钟。使用指定的一抗和相应的荧光二抗进行印迹。蛋白条带使用LI-COR Odyssey M成像系统（LI-COR Biosystems, RRID:SCR_025709）可视化。RAS异构体丰度的比较使用LI-COR Image Studio软件进行，数据来自三个独立实验（n = 3），并通过内部参考的加载控制和外部参考的对照组进行归一化。

EGFR ELISA

根据制造商的说明，使用市售的人类可溶性EGFR ELISA试剂盒（ab269558）在每个细胞系中的25,000个细胞中定量EGFR的表达水平。简要来说，先将50 μL样品或标准品加入指定孔中，立即加入50 μL抗体混合物。然后将平板密封并在室温下以400 rpm的转速孵育1小时。Wells 经历了三次连续的清洗，每次使用 350 μL 的 1× 清洗缓冲液 PT，每次清洗循环至少孵化 10 秒。通过倒置平板并将平板在吸水纸上擦拭来去除剩余的缓冲液。对于比色检测，向每个孔中加入 100 μL 的 TMB 底物，然后在黑暗中以 400 rpm 的速度孵化 10 分钟。通过加入 100 μL 的停止溶液并搅拌 1 分钟来终止反应，以确保充分混合。使用 Tecan Spark 多模态微孔板读取器（RRID:SCR_021897）在 450 nm 处测量吸光度。

EGFR 在酪氨酸 1068 处的磷酸化通过基于细胞的 ELISA [Human EGFR (Phospho; pY1068) ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific, KHR9081] 按照制造商的说明进行定量，每个细胞系使用 25,000 个细胞。将细胞裂解液（100 μL）转移到指定的孔中，空白染色孔保持空置。将平板密封并在室温下以轨道振动方式孵化 2 小时。通过吸液去除裂解液，然后用 1× 清洗缓冲液对孔进行四次连续清洗。向每个孔中加入针对人 EGFR (pY1068) 的检测抗体（100 μL），然后在室温下轻轻摇动（30 RPM）孵化 1 小时。吸液并再清洗四次后，向除空白染色孔外的所有孔中加入 100 μL 的 1× 抗兔 IgG 酚过氧化物酶（HRP）结合物，随后在室温下孵化 30 分钟。吸液并再次清洗四次后，向每个孔中加入 100 μL 的稳定染色底物，在黑暗中室温下孵化 30 分钟。使用 Tecan Spark 多模态微孔板读取器（RRID:SCR_021897）在 450 nm 处测量吸光度值。

RAS-GTP 测定（SDS-PAGE 分析）

使用 Active Ras Pull-Down and Detection Kit（Thermo Fisher Scientific）根据供应商的说明，通过亲和捕获法捕获 GTP 结合的 RAS 同型。通过免疫印迹法定量 RAS 蛋白水平。RBD 富集的裂解液使用以下一级抗体进行 Western blot 分析：小鼠单克隆抗 KRAS（Sigma-Aldrich，货号 #WH0003845M1，RRID:AB_1842235）、兔多克隆抗 NRAS（Proteintech，货号 #CL650-10724，RRID:AB_2923963）、兔多克隆抗 HRAS（Abcam，货号 #ab32417，RRID:AB_726959）和小鼠单克隆抗 GAPDH（Santa Cruz Biotechnology，货号 #sc-47724，RRID:AB_627678）。总细胞裂解液用小鼠单克隆抗 PERK（BioLegend，货号 #675502，RRID:AB_2565604）和大鼠单克隆抗总 ERK（BioLegend，货号 #686902，RRID:AB_2629535）进行检测。一级抗体在 LI-COR Intercept 阻断缓冲液（927-66003，LI-COR）中以 1:1,000 的比例稀释。

细胞裂解液按照 Bio-Rad Laboratories 的 ReadyPrep 2-D Cleanup Kit 的说明进行处理。对于等电聚焦，将 50 μg 的蛋白质样品重新悬浮在含 8 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、0.5% IPG 缓冲液（pH 3–10）和 1 mmol/L DTT 的复水溶液中。在一维分离中，使用 Criterion IEF 凝胶（pH 3–10 渐变）进行阶梯电压处理：首先 100 V 等待 60 分钟，然后 250 V 等待 60 分钟（总共 120 分钟）。IEF 后，凝胶条依次在两种缓冲液中平衡：首先在 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、6 mol/L 尿素、30% 甘油、2% SDS 和 1% DTT 中平衡 15 分钟，然后在类似缓冲液中替换 2.5% 碘乙酰胺代替 DTT。对于二维分离，将平衡后的凝胶条施加到 12% 聚丙烯酰胺 Criterion 无孔凝胶（Bio-Rad）上，并在 Tris–glycine–SDS 流动缓冲液（25 mmol/L Tris、192 mmol/L glycine、0.1% SDS）中以 120 V 电泳大约 2 小时。然后将在 4°C 下用 5% SDS 溶液浸泡 IEF 凝胶 30 分钟并轻轻搅拌。使用 Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad）以恒定电压 25 V 将分离出的蛋白质转移到 PVDF 薄膜上，时间为 1 小时，并使用预冷的转移垫。使用 pan-RAS 一级抗体（Active Ras Pull-Down and Detection Kit, Thermo Fisher Scientific）和二级抗体（Novus，货号 #NBP1-72928，RRID:AB_11007407）对薄膜进行免疫检测。使用 LI-COR ODYSSEY M 成像系统（RRID:SCR_025709）检测信号。

在 T-75 培养瓶中生长的细胞在吸除培养基后用冰冷的 Tris 缓冲盐水（TBS）冲洗。将细胞刮入 1 mL 的提取缓冲液 [25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、1% NP-40、5% 甘油] 中，然后在冰上破碎细胞，并定期涡旋 10 秒间隔进行处理，如前所述进行 RBD 亲和沉淀。将 RBD 结合的蛋白质在 12% SDS-PAGE 凝胶上分离，提取对应于 21-kDa 分子量区域的蛋白质条带。通过在 95°C 下加热 5 分钟溶解凝胶条，然后按照供应商的说明使用 ReadyPrep 2-D Cleanup Kit（Bio-Rad Laboratories）处理蛋白质。将纯化的样品与 50% 甘油样品缓冲液混合并在室温下平衡 20 分钟。将样品和 IEF 分子量标准品加载到 Criterion Bio-Lyte IEF 凝胶（pH 3–10 范围，Bio-Rad Laboratories）上。一维聚焦使用两步电压梯度：首先 100 V 等待 60 分钟，然后 250 V 等待 60 分钟（总聚焦时间：120 分钟）。聚焦后，将凝胶在 4°C 下用 5% SDS 溶液浸泡 30 分钟并轻轻搅拌。使用 Trans-Blot Turbo System（Bio-Rad Laboratories）和预冷的转移垫以恒定电压 25 V 将分离出的蛋白质电转移到 PVDF 薄膜上，时间为 1 小时。使用 pan-RAS 一级抗体（Active Ras Pull-Down and Detection Kit, Thermo Fisher Scientific）和抗小鼠 DyLight 800 二级抗体（Novus，货号 #NBP1-72928，RRID:AB_11007407）对薄膜进行免疫检测。使用 LI-COR Image Studio 软件（RRID:SCR_015795）进行定量分析，并将结果归一化到输入对照组和处理组，表示相对于溶剂处理的样品。通过计算 IEF 凝胶上 KRAS、HRAS 和 NRAS 条带的平均荧光强度来确定 RAS 同型 GTP 水平。RMC-6236 条带的强度计算为每个条带的平均强度。整体 GTP 的减少量表示相对于 DMSO 对照组的三种条带强度的总和。使用以下公式计算阻塞比例：ΔsignalRBD-PD ? ΔSignalRBD+Cyclosporine。GTP 氢解量等于 ΔsignalRBD+cyclosporine。

使用带有 GST 标签的 CyPA 的亲和捕获法捕获 GTP 结合的 RAS 同型。PANC-1 同源细胞用冰冷的 TBS 清洗一次，然后在含有蛋白酶抑制剂的裂解/结合/清洗缓冲液 [25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、1% NP-40 和 5% 甘油；每 75 cm2 培养瓶 1 mL] 中裂解。将裂解液在 4°C 下旋转孵育 15 分钟，转移到微量离心管中，并在 4°C 下以 16,000 × g 旋转 15 分钟进行离心澄清。上清液转移到新的试管中，使用 Pierce 660 Protein Assay（Thermo Fisher Scientific）或在 660 nm 处测量蛋白质浓度。对于每个结合反应，向旋柱中加入 50 μL 的谷胱甘肽树脂浆，并用裂解/结合/清洗缓冲液清洗 3 次。柱子在每次清洗之间以 6,000 × g 离心 10 秒，然后丢弃上清液。向树脂中加入 GST-CypA 融合蛋白（80 μg）和 1 μmol/L RMC-6236 或 GST-CypA 融合蛋白和 DMSO，并在冰上孵育 30 分钟以允许结合。然后用缓冲液清洗柱子 3 次，并像之前一样离心。通过加入 40 μL 的 2 × Laemmli 样品缓冲液，在 70°C 下加热 10 分钟后离心收集洗脱液。

小鼠研究按照 MCW 动物资源部门和机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 AUA00008123）批准的方案进行。NOD-SCID IL2Rγ?/? 小鼠（RRID:IMSR_NM-NSG-021）在研究第一天通过皮下注射 1 × 10^6 个细胞（100 μL 生理盐水）到右側胁部的下方。在指定的时间点通过卡尺测量肿瘤生长，体积使用以下公式计算：V = ? (Length × Width^2)。考虑到人类中 PDAC 在两性中的发病率相当，实验组包括雄性和雌性小鼠，并在处理组中均匀分配。同性的同胞小鼠被分配到不同的实验组。主要的统计分析汇总了两性数据，性别分层的亚组分析未显示显著差异。支持人类肿瘤植入的 NOD-SCID IL2Rγ?/? 小鼠（RRID:IMSR_NM-NSG-021，The Jackson Laboratory，品系 #005557）在 2 至 4 个月大时被纳入研究，这与该领域的既定做法一致。动物在 MCW 的特定无病原体条件下饲养，光照/黑暗周期为 12 小时，环境温度保持在 23°C，相对湿度在 30% 和 70% 之间。小鼠可以自由进食和饮水。

对于贴壁细胞，将 1.5 × 10^6 个细胞接种到含有完整培养基的 T-12.5 培养瓶中。当细胞达到 70% 的汇合度时，通过添加 100 μL 的 NANOSHUTTLE-PL（Greiner Bio-One，657841）进行磁化，该溶液在室温下摇晃 10 次以确保均匀性。细胞在 37°C 下与 NANOSHUTTLE-PL 共同孵化最多 16 小时，并伴有 5% 的 CO2，然后用 PBS 清洗并使用 TrypLE Express Enzyme（Gibco）溶解细胞。将细胞重新悬浮在完整培养基中，并通过台盼蓝排除（0.4% 台盼蓝，Bio-Rad）评估细胞活力。

解离的肿瘤细胞在 200 RCF 下离心沉淀。将细胞沉淀重新悬浮在 Human Wash Media 中，并加入 30 μL 的 NANOSHUTTLE-PL（在室温下摇晃 10 次预先混合）。将悬浮液混合 50 次，然后进行三次 30 × g 的离心，每次 5 分钟，之后用 50 次重复的移液步骤重新悬浮细胞。将磁化的细胞（每个孔最多 2 × 10^6 个）接种到具有细胞排斥表面的六孔细胞培养板（Greiner Bio-One，657970）中，总体积不超过 2 mL。将六孔中间盖（Greiner Bio-One，657825）放置在板上，然后放置六孔悬浮驱动器（Greiner Bio-One，657830）。轻轻旋转板以聚集细胞，并在 37°C 下伴有 5% 的 CO2 孵育 1 小时。收集带有细胞外基质的细胞，彻底重新悬浮到所需的细胞浓度，并转移到具有细胞排斥表面的 96 孔细胞培养微孔板（Greiner Bio-One，655970）中，每孔 135 μL。将微孔板放置在 96 孔环形驱动器（Greiner Bio-One，655850）上，轻轻旋转以促进细胞聚集，并在 37°C 下伴有 5% 的 CO2 孵育 2 小时。去除磁力驱动后，使用 Odyssey M 成像系统（LI-COR Biosciences）的 RGB 传输通道以 20 μm 的分辨率成像球状结构。在处理后的 24 和 48 小时时间点进行成像。

细胞在 96 孔板中的 3D 培养的显微镜图像使用定制的 Python 脚本（v3.12.7）进行分析。使用 Python Imaging Library（v10.4.0）从原始图像中裁剪出单个孔的图像。随后对每个裁剪后的孔图像进行特征提取。使用深度学习进行特征提取：使用在 ImageNet 上预训练的 ResNet-50 卷积神经网络（18）生成孔图像的特征表示，该网络作为转换器（v4.48.2）模型在 Hugging Face 上提供（https://huggingface.co/microsoft/resnet-50）。该模型在 NVIDIA GeForce RTX 4050 GPU 上使用 torch（v2.6.0+cu126）和 CUDA（驱动程序 v12.7.33）运行。对于每个孔，生成四个旋转版本（0、90、180 和 270 度），并独立计算编码向量。每个孔的最终表示是四个旋转得到的编码向量的平均值，提供旋转不变性。

为了量化随时间的降解，计算每个孔在基线（时间 0）的平均编码向量。在后续时间点，使用 NumPy（v1.26.4）的余弦相似度比较旋转平均的编码向量与基线向量：Cosine similarity(A, B) = A · B ||A||B||B||。这个相似度分数用作每个孔的降解指标，其中相似度降低表示与基线形态的差异越大。值为 1 表示没有差异，随着图像的差异增加，值会向 0 减小。

为了考虑孔间的变异性，对技术重复实验的相似度分数进行归一化。将重复孔分组，并将其降解指标平均以获得用于下游分析的标准化值。平均余弦相似度分数进一步通过使用实验中的最高和最低相似度分数进行了归一化，使其范围在0到1之间。所有代码都可以作为Python包在GitHub上获取：https://github.com/tmcfall85/McFallLab/blob/main/mcw_utils/donut_quant/README.md。

体外器官型培养测定

肿瘤活检和培养平台

通过MCW外科肿瘤组织库（IRB PRO00033119）从PDAC患者中获得图像引导的核心活检样本。样本在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素（Gibco）的冷的RPMI 1640中运输。在15至30分钟内，制备3至4毫米厚的切片，并将其放置于24孔板中的0.4毫米膜插入物（Millicell-CM，PICM01250）上，这些孔板中装有含有L-谷氨酰胺（Gibco，11875-085）、10% FBS（Corning，35-011-CV）和1%青霉素/链霉素（Gibco）的RPMI 1640。切片在37°C和5% CO2条件下培养，每2至3天更换培养基。24小时后，切片接受药物处理24至48小时，然后通过MTT测定进行活力评估，并进行苏木精和伊红（H&E）染色以及IHC分析。

肿瘤活力评估

使用MTS（Promega CellTiter 96，G3580）进行肿瘤活力评估。切片与MTS溶液（1:5比例）在37°C下孵育3至4小时，然后在490 nm处测量吸光度（SpectraMax iD5）。

切片面积通过ImageJ手动追踪进行量化。

组织学

经过福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）的切片进行了H&E染色。使用QuPath软件量化核密度、肿瘤含量和肿瘤/基质比率。

FFPE切片脱蜡后，用3% H2O2（Merck，61868505001730）处理，并进行抗原修复（Vector，H-3300）。使用2.5%马血清（Vector，MP-7800-15）封闭后，切片在4°C下过夜孵育，加入一抗：切割的caspase-3（1:50，R&D Systems，MAB835-SP）、Ki-67（1:50，Santa Cruz Biotechnology，sc-23900）、CD45（1:50，Santa Cruz Biotechnology，sc-1187）或EpCAM（1:50，Santa Cruz Biotechnology，sc-25308）。然后加入二抗（Vector Immpress HRP，MP-7800-15）孵育1小时，随后进行3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色（Vector ImmPACT DAB，MP-7800-15）和苏木精复染。

Ki-67+、切割的caspase-3+、CD45+和EpCAM+细胞由三位独立观察者通过QuPath软件进行量化，并对不一致的结果达成共识。

DNA分离和全外显子组测序

根据制造商的说明书，使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，商品编号#K0721/K0722）从贴壁的PANC-1细胞系（G12D、G12R、G12D-RR和G12R-RR）中分离基因组DNA。简要步骤为：每孔收获1 × 10^6个细胞，用胰蛋白酶处理，以250 × g离心5分钟，然后用PBS洗涤一次以去除残留的培养基。将细胞沉淀重悬在200 μL PBS中，加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K溶液，然后在56°C下孵育10分钟并偶尔涡旋。在室温下用20 μL RNase A溶液处理10分钟后，加入400 μL 50%乙醇，将裂解液转移到GeneJET基因组DNA纯化柱中。经过Wash Buffer I和Wash Buffer II依次洗涤后，基因组DNA用200 μL洗脱缓冲液洗出，并在?20°C下保存以备进一步分析。全外显子组测序由Novogene使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行DNA文库制备。文库在NovaSeq X Plus平台上使用150 bp的双端读取（PE150）进行测序。

通过商业临床级基因组分析平台Tempus xT assay（Tempus AI, Inc.）评估患者肿瘤中的体细胞改变，该平台通过了临床实验室改进修正案（CLIA）认证，是美国病理学家学院认可的下一代测序面板，覆盖648个基因。肿瘤组织根据平台的标准临床工作流程提交给Tempus进行测序和变异检测。在daraxonrasib治疗期间识别出的变异与已获得的协同变异进行了比较。

为了恢复G12D-RR细胞中的CypA表达，使用Lipofectamine 2000将编码全长人类CypA的pcDNA转染到细胞中。在下游实验之前，通过Western blot确认CypA的恢复。对G12R-RR细胞也应用了相同的过表达方法作为对照。恢复或过表达CypA的细胞在含有daraxonrasib的培养基中维持，并按照上述方法评估KRAS-GTP水平、pERK和增殖情况。

患者切除的转移瘤中的EGFR表达通过MCW病理服务的IHC进行评估。FFPE肿瘤切片用anti-EGFR抗体[LSBio（LifeSpan），商品编号#LS-C95382-1，RRID:AB_1931104]进行染色，按照实验室的标准临床协议操作。EGFR阳性程度通过膜染色百分比和强度评分确定，并由经过认证的病理学家解读。

为了正交验证环状结构的溶解作为药物诱导细胞增殖的指标，在指定的时间点用移液管轻轻破坏环状结构，然后将其转移到不透明壁的96孔板中。按1:1的比例加入CellTiter-Glo 3D试剂（Promega，G9681）与培养基，然后在室温下振荡孵育10分钟以促进细胞裂解。使用Tecan SPARK Multimode Microplate Reader（RRID:SCR_020543）测量荧光强度，并将信号标准化为vehicle处理过的孔的强度。

处理后，环状结构被分离，制备单细胞悬浮液以进行活力分析。细胞与0.4%台盼蓝溶液以1:1的比例混合，并加载到双室计数载玻片上。使用Bio-Rad TC20自动细胞计数器（RRID:SCR_025462）量化存活细胞和死亡细胞的百分比，该计数器根据膜完整性区分活细胞（台盼蓝不可渗透）和死亡细胞（台盼蓝可渗透）。每种处理条件下记录三次的总细胞计数、存活细胞计数和存活百分比。

生物学重复次数用“n”表示，实验重复次数在图例中指定。所有数据以平均值±标准差报告，并使用Prism 8软件（GraphPad；RRID:SCR_000306）进行分析。两个条件之间的统计显著性检验使用假设方差相等的非配对双尾t检验，且至少基于三个独立实验。三个或更多条件之间的统计显著性通过单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）后进行Tukey多重比较检验。显著性用*表示，P值分别为0.05、0.01、0.001、0.0001或确切值，并在相应的图中标注，使用的统计检验方法也包含在图例中。

KRASG12R表现出RAS信号传导减弱和对RAS抑制的敏感性增强

与KRASG12D相比，KRASG12R显示出不同的生化信号传导特征，整体RAS通路输出减少。因此，使用了携带KRASG12R或KRASG12D的PANC-1同源细胞系（13）。在三个独立克隆中，KRASG12R细胞的MEK和ERK磷酸化显著降低（图1A和B）。尽管KRASG12R的GTP水解和交换速率相对于KRASG12D降低（19），但它无法激活RASWT异构体（HRAS、NRAS），尽管KRASMUT活性升高，但总体RAS通路激活仍然较低（13）。RBD-IEF测定（14–16）证实KRASG12R细胞中的HRASWT和NRASWT激活降低（图1C和D），并且KRASG12R异种移植物的生长动力学延迟（图1E；补充图S1A），这与KRASG12R PDAC改善的临床结果和较低的ERK信号传导潜力一致（13, 20, 21）。图1。查看大图。

KRASG12R和KRASG12D的分子信号传导特征以及对KRASMUT抑制剂的治疗敏感性。A，PANC-1同源细胞（KRASG12D或KRASG12R）被免疫印迹检测pMEK、总MEK、pERK和总ERK，以GAPDH作为加载对照。B，量化（n = 3）显示PANC-1 G12R细胞中的pMEK和pERK降低。C，总RAS（输入）和活性RAS-GTP（使用RAF RAS结合域进行RBD沉淀）通过等电聚焦分离，并用pan-RAS抗体检测。D，输入（底部）和RBD捕获的RAS-GTP（顶部）的荧光量化显示G12R细胞中的HRAS/NRAS激活降低。E，NSG小鼠中的PANC-1同源系异种移植物的生长曲线（n = 5）；58天内的平均±标准差，代表三个实验（顶部）。研究期间小鼠体重没有差异（底部）。F，PANC-1 KRASG12D细胞用vehicle（DMSO）或10 μmol/L BI-3406处理12小时，然后免疫印迹检测RAS通路蛋白及其磷酸化形式。G，从F中的pMEK/pERK量化（n = 3）。H，提出的KRASG12D背景下RASWT激活的分子机制。I，PANC-1 KRASG12R细胞用vehicle（DMSO）或10 μmol/L BI-3406处理12小时，然后免疫印迹检测RAS通路蛋白及其磷酸化形式。J，从I中的pMEK/pERK量化（n = 3）。K，提出的改变SOS活性不影响KRASG12R背景下MEK/ERK信号传导的机制。L，PANC-1同源系细胞用对照siRNA或靶向KRAS的siRNA处理。24小时后，裂解物被免疫印迹检测KRAS、HRAS和NRAS（底部）；72小时后通过MTT评估存活性（顶部）。M，PANC-1同源系细胞用逐渐增加的RMC-6236浓度处理；5天后通过MTT评估存活性以确定IC50。N，来自未经处理的KRASG12D（P11A）和KRASG12R（P20B）活检的体外器官型切片培养物用DMSO或200 nmol/L daraxonrasib处理。（i）H&E确认肿瘤组织，（ii）24/48小时的MTS存活性，（iii）48小时的核密度量化。ns，不显著。O，在N之后，对每个患者的四个组织切片进行IHC检测pERK/ERK：（i）P11A和（ii）P20B。所有实验至少进行三次。统计显著性通过双尾非配对t检验（两组）或单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）后进行Tukey多重比较检验；*表示P值，分别在相应的图中标注。数据表示平均值±标准差。

图1。查看大图。在KRASG12D的PDAC中，RASWT的激活归因于两种机制：一种是KRASG12D作为神经纤维瘤蛋白1（NF1）的计量性结合位点，NF1是一种GAP（GDP-AMP酶），可以失活RASWT；另一种是GEF SOS1的别构激活，这会促进RASWT与GTP的结合（13）；这两种机制在KRASG12R中都不存在（13, 14, 22）。用SOS1抑制剂BI-3406处理KRASG12D细胞可以降低pMEK/pERK的水平（图1F–H），表明其信号传导依赖于SOS1，而KRASG12R细胞则没有这种效应（图1I–K），这与SOS1前馈激活缺失一致。由于PANC-1细胞表达的RTK水平很低（13），我们在无血清培养基中确认了这些效应与RTK无关（补充图S1B和S1C）；SOS1抑制同样降低了KRASG12D细胞（ASPC1、SW1990）的pMEK/pERK水平（补充图S1D），但不会影响KRASG12R细胞（PK8、PSN1、KP2）（补充图S1E），这与等基因型结果一致。网络假说预测，SOS1的抑制通过破坏SOS1介导的RASWT激活来降低KRASG12D细胞中的RASWT-GTP水平（HRAS、NRAS），而在G12R中这种相互作用不存在（13, 22）。在缺乏血清的条件下，SW1990（KRASG12D）中的基础HRAS/NRAS-GTP水平高于TccPan-2（KRASG12R），并且仅SW1990中的水平在BI-3406处理后降低，而TccPan-2的水平未受影响（补充图S1F），这支持了一种等位基因特异性的机制，即只有G12D而不是G12R可以通过SOS1激活RASWT。这种对KRASMUT信号传导的依赖性表明，在G12R背景下，细胞对KRAS靶向抑制剂更为敏感：遗传学上的KRAS敲低在G12R表达细胞中比在G12D表达细胞中更显著地抑制了增殖（图1L），并且KRASG12R细胞表现出更低的daraxonrasib IC50值（图1M）。在两名患者P11A（KRASG12D）和P20B（KRASG12R；图1N:i）的未经处理的活检组织中进行の体外器官型培养实验（补充图S2A）进一步证实了这一点：daraxonrasib在KRASG12R组织中导致的存活率降低和核密度减少比在KRASG12D组织中更明显（图1N:ii-iii）。免疫组化（IHC）结果也支持这一点：P11A表现出轻微的caspase切割和显著的CD45上调，同时Ki-67/EpCAM水平未变化（补充图S2B和S2C），而P20B则表现出强烈的caspase切割，CD45变化很小，Ki-67/EpCAM水平也无变化（补充图S2D和S2E），这与图1L和图1M中的结果一致。在48小时时，P11A的pERK/ERK IHC结果没有变化（图1O-i），表明其G12D信号传导响应延迟，而P20B的pERK/ERK IHC结果显著降低（图1O-ii），这与图1L和图1M中的增殖数据一致。Daraxonrasib显示出对不同RAS亚型的选择性抑制，优先作用于KRASMUT而非RASWT。

Daraxonrasib通过招募CypA到结合了GTP的RAS上来抑制RAS，形成一个三聚体，该三聚体通过空间屏障阻碍效应因子的结合并加速GTP的水解（23）。化学生物学研究表明它更倾向于与KRASMUT结合而不是RASWT（23），但在细胞内的选择性尚不清楚。预测的抑制生长所需的体内浓度为80 nmol/L（2），在我们的实验中有效抑制了细胞的增殖（图1M）。在PANC-1等基因型细胞中进行的RAS-GTP pull-down实验（RBD-GST）并随后通过IEF分离各个亚型（14–16）显示，daraxonrasib有效地阻断了KRASMUT-GTP与RBD的结合，而在KRASG12D细胞中，RASWT（HRAS、NRAS）与RBD的结合基本保持完整，表明RASWT的效应因子仍然可以结合（图2A–C）；定量结果显示KRASG12D的抑制接近完全（约90%至95%），而RASWT的抑制非常轻微（约10%至20%；图2B:i）。在无法激活RASWT的KRASG12R细胞中，无论是否处理，RASWT-GTP几乎检测不到，这起到了内部阴性对照的作用（图2A:i和B:ii）。图2。

Daraxonrasib对KRASMUT的优先结合超过了RASWT。A组，PANC-1的G12D和G12R细胞被80 nmol/L的RMC-6236处理24小时，然后通过两种RBD pull-down方法进行检测：（i）使用标准裂解/洗涤缓冲液保持CypA–RAS–GTP的结合，通过IEF分离并用pan-RAS抗体检测；（ii）加入环孢素A以破坏CypA的结合，从而直接检测RBD的结合；（iii）用整个细胞输入的裂解物通过IEF分离。B组，A组的定量结果（n = 3）：（i）处理组与RMC-6236处理组中RAS-GTP亚型与RBD的结合情况。C组，A组的定量结果（n = 3）：（i）RAS亚型与RBD结合的总减少量，（ii）由于GTP水解导致的信号丧失，（iii）由于CypA的空间阻断导致的信号丧失，以及（iv）这两种机制的组合效应。D组，PANC-1的G12D细胞在等摩尔的RMC-6236或DMSO控制下进行CypA-GST pull-down；捕获的RAS-GTP通过1D-IEF分离。E组，PANC-1的G12R细胞在等摩尔的RMC-6236或DMSO控制下进行CypA-GST pull-down；捕获的RAS-GTP通过1D-IEF分离。F组，每种RAS亚型与CypA结合的定量结果（n = 3）。G组，PANC-1 KRASG12D细胞中每个RAS亚型与CypA的结合/未结合比例。H组，CypA/RMC-6236复合体对KRASMUT-GTP的结合具有选择性偏好。I组，提出的耐药机制：RASWT亚型由于结合亲和力降低而绕过了daraxonrasib/CypA复合体的抑制。所有实验重复进行了3次。统计显著性通过双尾非配对t检验（两组）或单因素ANOVA并使用Tukey事后检验（≥3组）进行评估；*表示的数据在图中有标注。数据代表平均值±标准误差。I组数据由BioRender软件生成（McFall, T.，2026年）。为了建立稳定的耐药模型，我们将同基因型细胞系连续暴露于IC50浓度的daraxonrasib中数个月，期间不增加剂量，然后用厄洛替尼（EGFR抑制剂）或BI-3406（SOS1抑制剂）处理这些衍生的-RR细胞。KRASG12D-RR细胞在厄洛替尼处理下pERK和增殖能力均无变化，这与它们缺乏EGFR的功能一致（图3E）；而在BI-3406处理下，pERK仅有轻微下降，且没有增殖效应（图3F），这可能反映了KRASG12D的内在核苷酸交换速率（24）以及游离的KRASG12D-GTP仍具有一定的SOS1活性（13, 22）；pAKT未受到这两种药物的影响，这与PI3K在PDAC中不是主要的RAS效应因子一致（21）。相比之下，KRASG12R-RR细胞在厄洛替尼或BI-3406处理下pERK显著下降，增殖能力也显著减弱（图3G和H），表明它们的耐药性依赖于EGFR和RASWT。根据我们的系统网络假说（12–14, 16, 17），我们认为G12D-RR细胞通过保留的KRASG12D-GTP激活ERK信号通路来维持耐药性，而残余的RASWT活性通过别构激活的SOS1和抑制的NF1进一步增强（图3I（左）；而G12R-RR细胞则通过一个对daraxonrasib/CypA作用不敏感的信号通路来驱动RASWT-GTP的加载（图3I（右）。

表型检测确认-RR细胞系对daraxonrasib具有抗性，这通过MTT和菌落形成实验得到验证（图4A和B），并且这些细胞的pERK维持在能够完全抑制亲本细胞的浓度水平（图4C），全外显子测序也证实了MAPK的稳定重新激活，没有出现RAS网络的协同作用。不同的代谢途径适应使得KRASG12R和KRASG12D PDAC细胞对daraxonrasib产生不同的耐药性。A组中，PANC-1的G12D和G12R细胞在IC50浓度的RMC-6236下处理超过10代后产生了耐药细胞系（-RR）；无论是G12D-RR还是G12R-RR，其IC50值都没有显著变化。B组中，PANC-1的G12D、G12D-RR、G12R和G12R-RR细胞在逐渐增加RMC-6236浓度处理14天后进行菌落形成实验。C组中，Western blot分析显示在24小时处理后，随着RMC-6236浓度的增加，ERK的磷酸化程度也在增加。D组中，Western blot分析了PANC-1 G12R和G12R-RR细胞中的RAS/MAPK信号蛋白、CypA和EGFR。E组中，对D组数据进行了量化（平均值±标准差，n=3）。F组中，同样进行了Western blot分析。G组中，进一步对结果进行了量化。H组中，通过二维凝胶电泳技术分析了PANC-1 G12R、G12R-RR、G12D和G12D-RR细胞 lysates中的RAS蛋白，并用pan-RAS抗体进行了检测；通过质荷比鉴定KRASMUT、HRAS和NRAS的亚型。I组中，通过二维凝胶电泳量化了亲本细胞和耐药细胞系中的RAS亚型表达。统计显著性采用双尾非配对t检验（两组）或单因素方差分析（≥3组）进行评估，P值在图中标出。数据显示为三次独立实验的平均值±标准差。

图4显示，PANC-1 G12R-RR细胞中的EGFR、HRAS和NRAS表达显著上调，而pMEK/pERK只有轻微下降；相比之下，G12D-RR细胞中的KRASG12D表达增加，这与pMEK/pERK上调相关，EGFR/HRAS/NRAS保持稳定，CypA表达下降（图4D和E）。所有细胞系中的pAKT没有变化，表明MAPK的重新激活主要是通过非PI3K/AKT途径实现的。二维凝胶电泳（图4H）显示G12R-RR细胞上调了HRAS/NRAS，同时下调了KRASG12R，使信号通路的比例从KRASMUT主导转变为RASWT主导（图4I（上）；而G12D-RR细胞中KRASG12D表达增加，但RASWT没有显著变化，保持了KRASMUT的主导地位（图4I（下）。

为了验证这些发现，我们通过连续低剂量处理6周，生成了其他KRASG12D（ASPC-1、SW1990、Pa-14C）和KRASG12R（TccPan-2、PSN1）细胞系的-RR衍生物。KRASG12D-RR细胞中的KRAS水平略有下降，与PANC-1的情况相反，这表明KRASMUT的上调并不是耐药的必要条件；pMEK/pERK在4小时处理后回升至正常水平，并且RASWT-GTP的加载持续（补充图S3B（左）；而KRASG12R细胞中EGFR/pEGFR表达升高，但其-RR衍生物中RASWT表现出补偿性上调，但没有进一步增加EGFR的表达（补充图S3B（右））。RAS-GTP pulldown实验显示daraxonrasib减少了G12R-RR细胞中RASG12R-GTP与RAF1-RBD的结合，但尽管有药物存在，RASWT-GTP仍然能与RBD结合（图5A:i）；CypA-GST pulldown实验确认daraxonrasib/CypA复合物选择性地结合了KRASG12R，且RASWT的参与有限（图5A:ii），表明RASWT-GTP仍可以自由结合其他效应因子，这可能是MAPK恢复的原因之一，尽管KRASG12R被有效抑制。图5进一步展示了在持续daraxonrasib处理下RAS通路重新激活的机制。由于G12D-RR细胞下调了CypA（图4F）并同时恢复了KRASG12D-GTP（图5B和C），我们推测CypA可用性的降低可能是导致耐药性的原因。在PANC-1 KRASG12D和G12D-RR细胞中，CypA的过度表达在RMC-6236处理后导致G12D-RR细胞中的KRAS-GTP丢失，而父代细胞中RAS-GTP亚型的变化在模仿组和CypA组之间没有差异（补充图S3C）。在含有daraxonrasib的培养基中，恢复非同源G12D-RR细胞中的CypA显著降低了KRAS-GTP、pERK和细胞增殖[图5G（上）]，而CypA的过度表达在保留内源性CypA的G12R-RR细胞中没有效果[图5G（下）]，这表明CypA表达的降低可能是耐药性G12D细胞中持续存在的KRASG12D-GTP的原因。KRASG12R患者在使用daraxonrasib后获得了长期缓解，之后才出现了获得性耐药性。

2025年3月，一位69岁的男性患者因转移性PDAC就医，此前已经接受了五种治疗方案（图6A），他于2022年5月被诊断为KRASG12R突变型疾病。一线治疗FOLFIRINOX（2022年6月至11月）产生了CA19-9和影像学上的反应；由于化疗引起的神经毒性，治疗方案降级为FOLFIRI维持治疗，直到2023年3月病情进展，总的无进展生存期（PFS）为9.7个月，超过了未经选择的FOLFIRINOX治疗PDAC患者的中位6.8个月（28），这与KRASG12R突变型疾病改善预后的趋势一致（图6A:i；参考文献20）。二线治疗吉西他滨/纳武利妥昔单抗（2023年4月）产生了反应和病情稳定，但由于神经毒性加重，治疗在2.8个月后停止。三线治疗daraxonrasib（2023年8月）得到了强烈的初始反应，这与KRASG12R突变型的高度敏感性相符，但由于毒性需要将剂量从每天400毫克降低到200毫克；患者在治疗开始约10个月后（2024年6月）病情再次进展（图6A:ii）。第四线和第五线的实验性抗体药物偶联物（针对c-MET和claudin 18.2）分别在11周和5周后导致病情迅速进展。患者在前三线治疗中实现了近24个月的疾病控制（7），daraxonrasib耐药后进行的Tempus xT分析显示基因组没有新的改变（图6A:iii）。图6。查看大图；下载幻灯片。

对daraxonrasib耐药的KRASG12R患者肿瘤的分子分析验证了临床前耐药机制。A，(i) 治疗时间线与CA19-9水平的关系，显示了患者就诊前接受的各种治疗方案；每种方案都因病情进展或化疗引起的周围神经毒性而停止。三线治疗daraxonrasib始于2023年8月，最初有反应，随后CA19-9水平升高，表明病情进展。(ii) 连续CT显示2024年4月至6月期间一个代表性的腹腔结节增大，确认了影像学上的进展；患者随后参加了两个连续的试验（第四线抗-c-MET ADC；第五线抗-claudin 18.2 ADC），两者都出现了快速进展。(iii) 第五线进展后的Tempus xT测序显示保持了KRASG12R突变型，没有新的基因组改变，与治疗前的分析一致。B，从患者的腹腔转移灶中提取的存活肿瘤细胞（通过FACS分离）通过RBD pull-down方法检测活性RAS-GTP；输入物质和RBD结合的物质通过1D-IEF和pan-RAS免疫印迹进行分析（i）。定量（n = 3）显示了总的RAS亚型分布（ii–iii）和RAS-GTP亚型组成（iv）。C，比较了实验室生成的daraxonrasib耐药细胞系（PANC-1 G12R-RR）和具有获得性daraxonrasib耐药的 patient源性肿瘤细胞（KRASG12R）中的KRASMUT、HRASWT和NRASWT的化学计量分布。D，由CLIA认证的病理服务机构（Wisconsin Diagnostic Labs）进行的肿瘤活检标本的IHC分析确认了EGFR阳性。E，针对细胞系库、PANC-1同源细胞及其RMC-6236耐药的衍生物（-RR）以及来自肝脏转移灶的患者细胞进行了EGFR（左）和磷酸化EGFR（右）的ELISA检测。F，使用CLIA认证的检测方法对患者的转移性肝病变和实验室耐药模型进行了分子分析，检测可行的生物标志物。G，对PANC-1同源细胞系（KRASG12D和KRASG12R）及其RMC-6236耐药克隆进行了生化分析，证明通过EGFR和野生型HRAS/NRAS信号通路的重激活介导了对RMC-6236的耐药性。E的统计显著性通过单因素ANOVA和Tukey post hoc检验进行评估；*表示P值。数据代表三次独立实验的平均值±标准差。所有实验均进行了三次。图6。查看大图；下载幻灯片。

尽管从这位经过大量治疗的患者的活检中难以获得足够的肿瘤细胞，但我们开发了一种快速的3D生物打印平台（Greiner Bio-One），该平台可以在超低附着条件下生成环形结构，从而通过结构完整性和抗凋亡能力来加速药物敏感性评估（补充图S4；参考文献29–33）。我们首先使用PANC-1同源细胞系及其-RR衍生物验证了这种方法：G12D细胞在60 nmol/L的daraxonrasib浓度下显示出环形结构破坏，而G12D-RR环形结构在所有浓度下保持完整[图7A（左）]；G12R环形结构在20 nmol/L的浓度下溶解，而G12R-RR环形结构保持完整[图7A（右）]。余弦相似性量化检测到了这种溶解现象（补充图S5A），并通过trypan blue活力检测（补充图S5B）和CellTiter-Glo荧光检测（补充图S5C）进行了正交验证，这两项指标在显示环形结构丢失的孔中都有显著下降。余弦相似性比trypan blue排除法具有更高的敏感性，并且与CellTiter-Glo的结果更一致，表明daraxonrasib主要表现为细胞周期抑制剂而非细胞毒性物质，即使是部分代谢抑制也足以破坏环形结构。图7。查看大图；下载幻灯片。

临床前建模发现了daraxonrasib耐药的KRASG12R PDAC中对trametinib的敏感性。A，PANC-1同源细胞系（G12D、G12R）及其-RR衍生物被生物打印成3D环形结构，并在超低附着条件下用逐渐增加浓度的RMC-6236处理48小时。环形结构的破坏（红色框）表示药物敏感性及抗凋亡能力的丧失。B，患者来源的肿瘤细胞被生物打印成3D环形结构，并用40 nmol/L的RMC-6236处理。(i) 30分钟和48小时时的代表性图像，(ii) 结构偏差与基线的像素映射量化，(iii) 余弦相似性与0小时的比较显示48小时内结构保持完整，表明持续耐药性。C，PANC-1同源细胞及其-RR衍生物被用逐渐增加浓度的trametinib（TRM）处理24小时，并进行了pERK、ERK和tubulin的免疫印迹。D，从C（n = 3）中量化pERK/ERK。E，PANC-1 G12R和G12D同源细胞系及其-RR克隆被接种并培养形成菌落，并用逐渐增加浓度的TRM处理2周。F，PANC-1 -RR衍生物（G12D-RR、G12R-RR）被生物打印成3D环形结构，并用逐渐增加浓度的TRM处理48小时。环形结构的破坏（红色框）表示药物敏感性及抗凋亡能力的丧失。G，患者来源的肿瘤细胞被生物打印成3D环形结构，并用5 nmol/L的TRM处理。(i) 30分钟和48小时时的代表性图像，(ii) 结构偏差与基线的像素映射量化，(iii) 余弦相似性与0小时的比较显示48小时内结构完整性丧失，表明在daraxonrasib耐药的患者细胞中对低剂量MEKi的高度敏感性。H，患者来源的肿瘤细胞被生物打印成3D环形结构，并用DMSO、氯喹（CQ；40 μmol/L）、厄洛替尼（ERL；500 nmol/L）、吉西他滨（GEM；20 μmol/L）或组合处理。红色框表示环形结构的溶解；随后通过trypan blue排除法确定每种条件下的存活/死亡细胞百分比。所有实验均进行了三次。图7。查看大图；下载幻灯片。

尽管从患者活检中获得的肿瘤细胞数量有限，我们仍使用该平台生成了患者来源的环形结构。使用40 nmol/L的daraxonrasib处理48小时后，显示出结构完整性未受影响，且没有形态学变化（图7B），这再现了PANC-1 G12R-RR细胞的耐药表型，并证实了患者肿瘤中的持续性耐药性。耐药信号网络提示了两种联合治疗的靶向疗法：EGFR抑制剂或与trametinib联合使用的MEK抑制剂。在同系细胞系中测试不同剂量时，KRASG12R-RR细胞对trametinib的敏感性显著高于其他所有细胞系，而后者仍然保持耐药性（补充图S6）。鉴于KRASG12R的信号传导较弱以及MEK磷酸化水平降低，我们进一步研究了MEK抑制剂的作用：Trametinib优先结合未磷酸化的MEK，从而阻断RAF介导的激活（34, 35），这表明对daraxonrasib耐药的KRASG12R PDAC细胞，由于其KRASG12R向RASWT的转换以及pMEK/pERK水平的降低（图4D），可能对trametinib表现出更高的敏感性。在异系模型和耐药衍生物中的实验也证实了这一点：PANC-1 G12D/G12D-RR对trametinib耐药，而G12R/G12R-RR则敏感，且G12R-RR的敏感性高于其亲本细胞G12R（图7C和D），这一结果与增殖实验（补充图S6）和克隆形成实验（图7E）中的IC50值相符，证实了trametinib能够在不受daraxonrasib影响的情况下抑制KRASG12R细胞中的MAPK信号通路（13）。在快速生物打印的G12D-RR细胞球体模型中也进一步评估了trametinib的敏感性：G12D-RR球体在所有浓度下均保持完整，而G12R-RR球体在低至2.5 nmol/L的浓度下就发生破坏（图7F），这证实了MEK抑制剂对不同等位基因的敏感性差异。使用载体或低剂量（5 nmol/L）trametinib处理患者来源的球体48小时后，肿瘤完全被破坏（图7G），表明肿瘤对MEK抑制剂具有高度敏感性，这与PANC-1 G12R-RR细胞的情况相似，支持基于trametinib的治疗方案。根据我们机构的分子肿瘤委员会指南，联合治疗方案优先于单一疗法，因此将剩余的肿瘤组织进行生物打印，以便筛选可用于本实验方案的FDA批准药物（如氯喹、厄洛替尼和trametinib），所选浓度接近胰腺癌患者体内的实际浓度（13, 22, 36, 37）。单独使用或与其他药物联合使用trametinib和厄洛替尼均可导致细胞球体解体，但当trametinib与吉西他滨联合使用时，细胞杀伤效果最佳（图7H）。在daraxonrasib耐药后，联合治疗方案能够控制疾病。

鉴于该患者已接受过大量治疗，厄洛替尼和trametinib存在共同的毒性反应（如皮疹、腹泻）及耐受性问题，我们选择了单药trametinib而不是EGFR/MEK联合抑制剂，原因包括：（i）在第一线非转移性PDAC患者中，厄洛替尼联合吉西他滨的治疗效果优于单独使用吉西他滨（无进展生存期PFS为6.2个月 vs 5.9个月；参考文献38）；（ii）基于trametinib的治疗方案在早期KRASG12R PDAC患者中的中位无进展生存期（PFS）为6.8个月（13）；（iii）有病例报告表明，尽管之前已经使用过吉西他滨，但在晚期KRASG12R PDAC患者中，吉西他滨与MEK抑制剂联合使用仍能取得治疗效果（39）。初次诊断时，患者已接受过五种治疗方案，CT扫描显示肝脏、肺部和腹腔疾病有所进展，与6至7周前的检查结果相比。由于MEK抑制剂主要具有细胞抑制作用（补充图S5），因此添加了吉西他滨来针对EGFR/RASWT依赖性的肿瘤异质性；同时添加了羟氯喹，因为先前数据表明羟氯喹可以通过抑制自噬介导的耐药性来增强trametinib的效果（13, 22, 40）。患者于2025年3月开始接受治疗，每日服用1 mg的trametinib（批准剂量为2 mg），每日两次服用600 mg的羟氯喹，以及每28天中的第1、8和15天服用800 mg/m2的吉西他滨（批准剂量为1,000 mg/m2），治疗效果显著，CA19-9指标明显下降，肿瘤影像稳定长达5个月（图8B）。治疗过程中患者仅出现轻微的皮疹、口腔溃疡、疲劳和血小板减少等症状。大约5个月后，病情迅速恶化（见代表性 liver lesion，图8C），疼痛加剧，最终在2025年8月底去世，从诊断开始的总生存期为40个月。

第六线治疗在daraxonrasib耐药的转移性PDAC中取得了持久的疗效。A选项显示了连续的CT扫描结果；B选项记录了在使用MEK抑制剂联合疗法期间CA19-9指标的变化；C选项为时间线。在治疗开始的2-3周内，病情迅速进展：2025年3月17日出现了新的肝脏病变（3月3日时未见），CA19-9指标从6,236（2025年3月4日）上升至25,309（2025年3月24日）。从2025年3月24日起，患者对治疗产生反应，CA19-9指标下降，肝脏病变趋于稳定。然而到2025年7月31日，病情再次恶化，CT显示肿瘤显著进展（自治疗开始已4.8个月），病变大小几乎翻倍（图8）。这一病例强调了三个关键点：KRAS等位基因的差异决定了耐药机制；实时转化研究可以缩短实验性药物失败与挽救性治疗之间的时间差距；即使在经过大量治疗的晚期疾病中，基于分子信息的适应性策略也能延长生存期。KRASG12R无法重新激活RASWT，这使得其对RAS抑制剂最初表现出高敏感性，并限制了耐药途径的发展，即使在疾病进展后仍存在可利用的脆弱性，这一点在缺乏基于证据的指导原则的情况下，通过患者来源的临床数据和临床前研究结果得到了证实。KRASG12R相对于常见的KRASG12D和KRASG12V突变体具有独特的生物学特性：它缺乏SOS1变构激活机制，也不能作为NF1的配体，从而减弱了RASWT的活性（13–17）。这种整体RAS信号通路的减弱可能解释了其在小鼠模型中较低的致癌潜力（13, 20, 22），这与KRASG12R在分化较好的局部PDAC中的富集情况一致，而KRASG12D则更常见于转移性PDAC（20, 41）。许多对靶向治疗产生耐药性的患者（包括对sotorasib和adagrasib等KRASG12C抑制剂）缺乏可识别的基因组突变（10），这反映了蛋白质水平上的信号重塑，超出了测序技术的检测范围。尽管下一代测序对于耐药性分析至关重要，但蛋白质表达和信号传导的适应性变化需要综合性的研究方法；在本研究中，daraxonrasib耐药后未出现新的可操作突变，耐药性可能是通过EGFR和RASWT在蛋白质水平上的上调和激活引起的。我们的综合功能方法结合了术中直接测量RAS活性、RAS信号通路的比例分析以及在手术获得的组织上进行的体外药物敏感性测试，确定了EGFR/RASWT轴是耐药机制，强调了在耐药性研究中结合蛋白质水平和功能分析的价值。已有研究表明KRASG12D PDAC对MEK抑制剂和吉西他滨联合治疗具有耐药性（42），而KRASG12R肿瘤相对敏感，有个别病例甚至实现了22个月的疾病控制（13）。我们的KRASG12R模型表明EGFR/PI3K/AKT通路不太可能是耐药机制，耐药性可能是由EGFR/RASWT驱动的ERK通路介导的；鉴于患者的RASWT占主导的信号特征，我们推测trametinib、吉西他滨和羟氯喹将继续发挥抗肿瘤作用，这与之前在G12R细胞中的研究结果一致。相反，对daraxonrasib耐药的KRASG12D模型中，KRASMUT-GTP保持活跃，CypA的水平下调，而且MEK抑制剂并未影响细胞增殖，这提示KRASG12D PDAC可能需要独立于CypA的KRAS抑制剂、针对pMEK的MEK抑制剂或ERK抑制剂。最近的一项使用等位基因锚定CRISPR-Cas9技术的补充研究在KRASMUT PDAC细胞系中发现了影响KRASi敏感性的基因修饰因子，包括EGFR、CK2和YAP，也显示了等位基因特异性的耐药性和KRAS依赖性（43）。尽管该研究使用了群体水平的基因扰动和高剂量处理，但我们的工作利用了系统生物学和基于患者来源的长期低剂量耐药性模型，实时捕捉了非遗传性的、表达水平的机制，为基于等位基因的靶向治疗提供了实用的框架。尽管观察到的KRASG12R耐药机制主要是EGFR/RASWT活性相关的，但仍然存在其他可能的通路。KRASG12R的扩增是一个理论可能性，然而生物物理学上的限制表明，要实现这样的扩增可能需要比KRASG12D更严重的扩增。在KRASG12D中，肿瘤可能会通过RASWT和KRASMUT均处于低活性的状态而表现出对MEKi的敏感性，尽管在疾病发展中这种状态可能会被选择淘汰；不过将RASWT、KRASMUT和EGFR联系起来的简化框架仍然具有合理性。我们的发现并不意味着只有这一种耐药机制，但这些结果在临床前、转化研究和临床环境中的一致性证明了该研究方法的价值。该病例展示了转移性PDAC中极为罕见的持久疗效，这种疾病的预后通常很差，晚期治疗选择有限。患者总共经历了六种治疗方案，总体生存期达到了约40个月，这在文献中几乎是前所未有的。只有大约一半的转移性PDAC患者适合接受第二线治疗（44），其中只有37%到48%的患者能够进入第三线治疗（45, 46），此时他们的总体生存期中位数为3.5到5.5个月（47）；关于第六线治疗的比较数据几乎不存在。这种持续的疗效反映了实时耐药性分析和基于肿瘤自身适应性的治疗选择的多方面策略，使得在缺乏基于证据的指导原则的情况下仍能实现有意义的疗效。

本研究生成的所有数据都包含在已发表的文章及其补充信息文件中，可通过联系相应作者获取。作者自制的非商业试剂也可根据需求提供。患者的基因组分析由Tempus实验室完成，该实验室具有CLIA认证。如需访问本研究未公开的数据，需要与相关商业公司签订数据使用协议。本研究生成的生物信息学数据已在Sequence Read Archive中公开，BioProject访问号为PRJNA1459483。用于图像预处理、基于ResNet-50的特征提取以及基于余弦相似度的圆盘图像退化量化的自定义Python代码可在GitHub上作为Python包获取：https://github.com/tmcfall85/McFallLab/blob/main/mcw_utils/donut_quant/README.md。该代码依赖于Python（v3.12.7）、Python Imaging Library（v10.4.0）、PyTorch（v2.6.0+cu126）、Hugging Face Transformers库（v4.48.2）及其预训练的ResNet-50模型（https://huggingface.co/microsoft/resnet-50）以及NumPy（v1.26.4）。生物信息学分析由Novogene使用其标准流程（BWA/GATK/ANNOVAR）完成。被鉴定为具有外显子或剪接功能的突变通过与OncoKB的数据交叉比对进行了筛选，并仅保留了具有潜在致癌效应的突变。所有用于生物信息学分析的自定义代码和脚本可在https://github.com/eke-osumc/McFall-VanillaScoop获取。访问OncoKB API需要单独的用户账户和OncoKB的批准。

作者的利益披露：
J.F. Langenheim报告在提交的工作之外从Kaida BioPharma获得了个人费用和其他支持；B.F. Volkman报告在提交的工作之外从Protein Foundry LLC和XLock Biosciences Inc.获得了支持；G.A. Hobbs在研究期间从PanCAN和Concern Foundation获得了资助；M. Kamgar在研究期间从Cornerstone Pharmaceuticals和1Cell.Ai获得了资助；其他作者未报告任何利益冲突。

作者的贡献：
D. Dorbin：概念设计、数据整理、研究、可视化、方法论构建、初稿撰写、审稿和编辑；
J. Herrera：概念设计、数据整理、正式分析、 supervision、验证、研究、初稿撰写、审稿和编辑；
R. Davidson：概念设计、数据整理、正式分析、 supervision、验证、研究、可视化、方法论构建、项目管理；
N.K. Chandrashekar：概念设计、资源获取、数据整理、软件开发和应用、正式分析、 supervision、验证、可视化、方法论构建、初稿撰写；
G. Scheuber：正式分析、验证、研究、可视化、方法论构建、项目管理、审稿和编辑；
P. Jayakrishnan：概念设计、正式分析、 supervision、验证、研究、可视化、方法论构建、项目管理、审稿和编辑；
C. Rajesh：数据整理、验证、研究、可视化、方法论构建、初稿撰写、审稿和编辑；
G. Johnson：数据整理、正式分析、验证、研究、可视化、方法论构建；
J. Yuan：数据整理、正式分析、验证、研究、可视化、方法论构建、初稿撰写、审稿和编辑；
M.A. Sochor：数据整理、软件开发和应用、正式分析、验证、研究、可视化、方法论构建、初稿撰写、审稿和编辑；
J.F. Langenheim：数据整理、正式分析、 supervision、验证、研究、可视化、方法论构建、初稿撰写、审稿和编辑；
M. Aldakkak：资源获取、数据整理、正式分析、验证、研究、可视化、方法论构建、项目管理、审稿和编辑；
C. Messerly：数据整理、正式分析、研究、方法论构建。维特曼（Wittmann）：形式分析、验证、调查、可视化、方法论、撰写及审稿编辑。
萨博（Szabo）：资源管理、数据整理、软件使用、形式分析、监督、撰写及审稿编辑。
赛亚普尔（Sayahpour, F.A.）：数据整理、形式分析、验证、调查、可视化、方法论、项目管理工作、撰写及审稿编辑。
阿塔拉（Atallah, N.L.）：数据整理、形式分析、验证、调查、方法论。
彼得森（Peterson, F.C.）：资源管理、数据整理、验证、调查、方法论。
沃尔克曼（Volkman, B.F.）：资源管理、数据验证、方法论研究。
阿里（Ali, M.）：资源管理、数据整理、形式分析、验证、调查、可视化、方法论研究、撰写及审稿编辑。
克（Ke, E.）：数据整理、软件使用、形式分析、验证、调查、可视化、撰写及审稿编辑。
埃文斯（Evans, D.B.）：资源管理、数据整理、项目监督、资金筹集、方法论研究、项目管理工作、撰写及审稿编辑。
蔡（Tsai, S.）：概念化研究、资源管理、数据整理、项目监督、方法论研究、项目管理工作、撰写及审稿编辑。
莱特尔（Lytle, N.K.）：概念化研究、资源管理、数据整理、形式分析、项目监督、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写及审稿编辑。
徐（Seo, Y.D.）：概念化研究、资源管理、数据整理、形式分析、项目监督、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写。
库尔兹罗克（Kurzrock, R.）：概念化研究、资源管理、数据整理、形式分析、项目监督、资金筹集、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写。
霍布斯（Hobbs, G.A.）：概念化研究、资源管理、数据整理、形式分析、项目监督、资金筹集、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写、项目管理工作及审稿编辑。
坎加尔（Kamgar, M.）：概念化研究、资源管理、软件使用、形式分析、项目监督、资金筹集、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写及审稿编辑。
麦克福尔（McFall, T.）：概念化研究、资源管理、数据整理、软件使用、形式分析、项目监督、资金筹集、验证、调查、可视化、方法论研究、初稿撰写及审稿编辑。

致谢
本研究独立完成， revolution medicines 公司未对该研究提供任何财务、智力或编辑方面的支持。
威斯康星医学院（Medical College of Wisconsin, MCW）外科部门：我们关怀基金（We Care Fund，负责人为麦克福尔和坎加尔）。
威斯康星医学院癌症中心（MCW Cancer Center）：伯恩学者基金（Byrne Scholar Fund，负责人为麦克福尔和库尔兹罗克）。
美国癌症协会（American Cancer Society）与威斯康星医学院癌症中心的合作研究项目（IRG #19-138-34，负责人为麦克福尔）。
美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、国家癌症研究所（National Cancer Institute）：项目编号 1R01CA276771-01A1（负责人为麦克福尔）。
美国国立卫生研究院：项目编号 L30CA284420，“利用 MEK 抑制剂进行胰腺癌精准医疗实践”（负责人为麦克福尔）。
胰腺癌行动网络（Pancreatic Cancer Action Network）职业发展奖（以斯基普·维拉格（Skip Viragh）命名，编号 22-20-HOBB，负责人为霍布斯）。
康塞尔基金会（Concern Foundation）职业发展奖（负责人为霍布斯）。
美国国立普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）：项目编号 P20GM130457（负责人为霍布斯）。
斯科特和辛西娅·麦卡菲胰腺癌精准医疗基金（Scott and Cynthia McAfee’s Fund for Pancreatic Cancer Precision Medicine，负责人为坎加尔和麦克福尔）。
克雷格·阿德尔曼基金（Craig Adelman Fund）、伯克哈特家族基金（Burkhardt Family Fund）以及迈克·威尔士胰腺癌研究基金（Mike Welsh Fund for Pancreatic Cancer Research，负责人为坎加尔、麦克福尔和徐）。
西奥多·W·巴特曼家族基金会（Theodore W. Batterman Family Foundation，负责人为坎加尔、麦克福尔和徐）。
乔尔和阿琳·李胰腺癌研究主席职位（Joel and Arlene Lee Chair of Pancreatic Cancer Research，负责人为坎加尔）。
我们感谢梅丽莎·梅纳（Melissa Mena）对“La Bahn 胰腺癌项目”的管理支持，以及她在整个研究过程中的协调工作；同时感谢辛西娅·麦卡菲（Cynthia McAfee）提供的帮助和相关信息。
注：本文的补充数据可在《癌症研究在线》（Cancer Research Online，网址：http://cancerres.aacrjournals.org/）获取。