素食餐降低老年大鼠蛋白质消化率但不改变餐后蛋白质利用率

《The Journal of Nutrition》：A vegetarian meal reduces protein digestibility without altering postprandial protein utilization in old rats

背景：膳食组成，尤其是其中的植物源性成分，可能降低蛋白质消化率和氨基酸（AA）可利用性。鉴于植物性膳食的日益普及，这一问题在蛋白质需求较高的人群（包括老年人）中尤为重要。目的：评估膳食背景对豌豆蛋白和氨基酸消化率及代谢在整个生命周期中的急性效应，比较素食餐与杂食餐。方法：48只1、10和18月龄雄性Wistar大鼠（每个年龄组n=16）在杂食餐或素食餐中摄入¹⁵N标记豌豆，6小时后处死。收集消化内容物用于蛋白质和氨基酸消化率测定。测定血浆和尿液¹⁵N富集度以评估脱氨基作用。采用¹³C-缬氨酸 flooding dose法测定肝脏和肌肉蛋白质合成。在肝脏、肌肉和肠黏膜中定量消化及蛋白质代谢相关基因表达。结果：素食餐使粪便豌豆蛋白消化率和盲肠氨基酸消化率略有降低（分别为93.5% vs. 94.7%，P = 0.01和90.5% vs. 93.7%，P = 0.0009），在老年大鼠中尤为明显（分别为92.5% vs. 94.2%，P = 0.03和89.7% vs. 93.6%，P = 0.02）。然而，该降低未影响氮利用率或蛋白质合成。年轻大鼠表现出更高的外周氮利用率，肌肉蛋白质合成较高（+70%，P < 0.0001），脱氨基作用较低（-70%，P < 0.0001），与生长需求一致。成年和老年大鼠表现出更高的肝脏蛋白质合成（+40%，P = 0.0004）和更高的脱氨基作用（+70%，P < 0.0001），表明向维持代谢转变，与餐型无关。结论：素食餐略微降低了蛋白质和氨基酸消化率，可能与其较高的抗营养因子含量有关，老年大鼠敏感性更高，但未损害餐后蛋白质代谢。长期研究应确定这些降低是否对衰老过程中的肌肉维持具有累积效应。意义声明：本研究提供了新证据，表明复杂素食餐对蛋白质消化率的负面影响可能随衰老而放大，而餐后蛋白质利用率尽管消化率降低仍得以保持。研究进一步表明，年龄相关的向内脏滞留和氨基酸氧化增加转变优先于餐型效应，突显衰老是植物蛋白利用的关键决定因素。

研究背景方面，近年来植物性膳食在西方国家日益流行，其驱动因素包括健康、环境和伦理考量。大量研究强调其健康益处，包括降低血压、降低缺血性心脏病风险和增加肠道微生物群多样性。此外，植物性食品生产通常资源密集度较低，温室气体排放少于畜牧业。然而，这种膳食转变引发了营养学担忧，因为植物蛋白通常被认为质量低于动物蛋白。蛋白质质量可定义为蛋白质满足年龄特异性氮和必需氨基酸（IAA）需求以保障正常生长和维持的能力。因此，蛋白质质量取决于氨基酸（AA）组成和生物利用度。植物蛋白通常表现出不平衡的必需氨基酸谱和较低的消化率（60–90% vs. 动物蛋白>90%）。这种较低的消化率部分可归因于植物基质中较高的纤维和抗营养因子（ANF，如植酸盐和单宁）含量。与此同时，北美、欧洲和日本等地区的人口老龄化引发了对植物性膳食是否适合老年人的疑问。衰老与合成代谢抵抗相关，需要更高的蛋白质摄入以维持肌肉质量和预防肌少症。因此，法国指南建议老年人摄入更高蛋白质（1.0 vs. 0.8 g·kg^-1·day^-1），但未充分考虑蛋白质质量差异，特别是许多植物蛋白通常较低的合成代谢潜力。年龄相关的消化变化，如酶分泌减少和胃排空延迟，可能进一步损害蛋白质消化和吸收。因此，年龄相关生理变化与某些植物蛋白较低质量之间可能产生潜在的不良协同效应。动物研究报告老年大鼠对低质量蛋白质的消化率降低，支持了这一观点。这提出了两个关键问题：在植物性膳食中摄入植物蛋白是否会进一步损害其消化率和氮利用率？此类膳食是否足以满足整个生命周期中的蛋白质和氨基酸需求，特别是在衰老和生长等需求增加的阶段？为解决这些问题，本研究评估了植物性膳食背景如何影响同一植物蛋白在不同年龄段的消化率和代谢命运。研究给年轻、成年和老年大鼠喂食含有内在¹⁵N标记黄豌豆的杂食餐或素食餐，从而精确追踪豌豆蛋白的消化和代谢命运。

研究人员开展了跨生命周期研究，使用48只1、10和18月龄雄性Wistar大鼠，分别在杂食餐或素食餐中摄入¹⁵N标记豌豆，6小时后处死，收集消化内容物、血浆、尿液、肝脏、肌肉和肠黏膜等样本。研究得出结论：素食餐略微降低蛋白质和氨基酸消化率，可能与其较高的抗营养因子含量有关，老年大鼠敏感性更高，但未损害餐后蛋白质代谢。年龄是餐后蛋白质代谢的关键决定因素，年轻大鼠优先将膳食氨基酸导向肌肉沉积，而成年和老年大鼠表现出更高的内脏滞留和氨基酸分解代谢。总体而言，这些发现表明均衡的植物性膳食可支持整个生命周期的餐后蛋白质代谢，尽管对衰老过程中的蛋白质消化率影响更大。研究意义在于提供了新证据，表明复杂素食餐对蛋白质消化率的负面影响可能随衰老而放大，而餐后蛋白质利用率尽管消化率降低仍得以保持；进一步证明年龄相关的向内脏滞留和氨基酸氧化增加转变优先于餐型效应，突显衰老是植物蛋白利用的关键决定因素。

关键技术方法方面，研究人员使用内在¹⁵N标记黄豌豆（由Terres Inovia通过施用双标记¹⁵N肥料获得）追踪豌豆蛋白和氨基酸的消化及代谢命运；采用¹³C-缬氨酸 flooding dose法测定肝脏和腓肠肌蛋白质合成率；通过测定消化内容物中¹⁵N和¹⁵N-AA回收率评估蛋白质和氨基酸消化率；通过血浆和尿液¹⁵N富集度评估脱氨基作用；采用RT-qPCR定量肝脏、肌肉和肠黏膜中消化及蛋白质代谢相关基因表达。样本来源为Janvier（法国Saint Berthevin）购买的雄性Wistar大鼠。

研究结果方面，形态学参数和食物摄入：衰老影响食物摄入、生长和体成分，而餐型未影响这些参数。15天实验期间，老年大鼠相对于体重的食物摄入低于年轻和成年大鼠。年龄显著影响体重，年轻和成年大鼠体重增加，而老年大鼠在研究期间略有下降。肝脏重量相对于体重在成年和老年大鼠中低于年轻动物。腓肠肌重量在老年大鼠中显著低于年轻和成年组。豌豆蛋白消化和代谢命运：总体而言，所有组别真实氮消化率均较高（>90%）。素食餐较杂食餐使真实粪便消化率略有但显著降低（93.5 ± 1.9% vs. 94.7 ± 1.3%；P = 0.01），尤其在老年大鼠中（P = 0.03）。盲肠消化率也发现类似降低（P = 0.0008），尤其在老年大鼠中（P = 0.01）。未检测到年龄或体重的总体效应。豌豆蛋白吸收后利用通过测定餐后6小时组织中¹⁵N滞留评估，包括内脏（肠组织、肝脏和血浆蛋白）和外周组织（骨骼肌）。肠黏膜掺入不受餐型、年龄或体重影响。餐型对豌豆氮掺入肝脏、血浆蛋白或肌肉也无影响，而年龄有显著影响。肝脏豌豆氮滞留随年龄增加（P < 0.0001），老年大鼠高于成年大鼠（P = 0.02）。血浆蛋白中豌豆氮回收在老年大鼠中也较高（P = 0.01），年龄（P < 0.0001）和体重（P = 0.005）有影响。腓肠肌中豌豆氮掺入与体重相关（P = 0.02），经体重调整后随年龄降低（P = 0.0001），但未观察到显著的成对差异。¹⁵N标记尿素在血液和尿液中也被量化作为膳食氨基酸脱氨基的标志物。与豌豆氮组织滞留类似，年龄对豌豆氮向尿素池转移有显著影响（P < 0.0001），而未观察到餐型或体重的影响。豌豆氮向体尿素转移在成年和老年大鼠中显著高于年轻大鼠（分别为P = 0.03和P = 0.007），导致这些组总体脱氨基作用更大。空肠黏膜中氨基酸消化率和肽及氨基酸转运体基因表达：为评估氨基酸吸收差异，从盲肠消化物中¹⁵N回收率测定单个氨基酸的真实消化率。平均消化率范围为89.7%至94.0%。与真实盲肠氮消化率一致，大多数豌豆氨基酸在素食餐中消化率较低，但蛋氨酸除外。因此，素食餐大鼠平均氨基酸消化率较杂食餐大鼠降低2.6%（90.5 ± 3.1% vs. 93.1 ± 2.0%；P = 0.0009）。必需氨基酸消化率表现出类似降低（91.3 ± 2.9% vs. 93.7 ± 1.9%；P = 0.0009），该效应主要由老年大鼠驱动。未观察到年龄或体重的总体效应。尽管年龄影响缬氨酸和丝氨酸消化率，但事后分析未识别出特定年龄组间的显著差异，也未出现一致的年龄相关模式。研究还通过定量空肠黏膜中关键游离氨基酸、二肽和三肽转运体的表达，探讨餐型和年龄是否影响氨基酸转运。餐型对转运体表达无影响，尽管消化率存在差异。相反，衰老与Pept1和氨基酸转运体（Slc6a19、Slc36a1、Slc6a14）表达的进行性增加相关。为进一步表征年龄相关的肠道功能变化，还评估了黏蛋白（Muc2、Muc3）和紧密连接蛋白（claudin 3、7和15）的表达，两者均参与肠道屏障功能，其表达也随年龄增加。肝脏和肌肉蛋白质代谢：测定肝脏和肌肉蛋白质合成率以评估膳食氨基酸在内脏和外周水平的利用。在肝脏中，绝对合成率（ASR）显示年龄的显著总体效应（P < 0.0004），也受体重影响（P = 0.002），餐型无影响。在腓肠肌中，ASR仅受年龄影响，年轻大鼠高于成年（P = 0.04）和老年大鼠（P = 0.05），而成年和老年大鼠显示相似值。为探索潜在机制，分析了参与蛋白质合成调节的基因表达，重点关注mTOR和GCN2通路，这两个控制合成代谢和分解代谢过程平衡的主要信号级联，以及通过Ulk1和Ub2E表达评估肝脏和肌肉中的蛋白水解途径。在肝脏中，衰老与Atf4、Trib3和Ddit3表达降低相关，餐型无影响。在肌肉中，基因表达不受膳食影响但受年龄调节：eIF-2α和Atf4在成年大鼠中较高，Trib3随年龄进行性增加，Ulk1表达在成年和老年大鼠中高于年轻大鼠。

讨论部分总结：本研究使用内在¹⁵N标记豌豆，探讨了餐食组成和年龄如何影响膳食豌豆蛋白和氨基酸的消化率及代谢命运。黄豌豆以浸泡、脱壳、煮熟和冻干形式提供给大鼠，掺入素食餐或杂食餐中。总体而言，本研究中豌豆蛋白和氨基酸消化率较高（90-95%）。这些值略高于Nosworthy等报道的喂食类似加工黄豌豆的Wistar大鼠粪便氮消化率（88%），但与Berrazaga等报道的喂食含79%裂荚豌豆粉的豌豆-小麦面食大鼠真实粪便氮消化率（约93%）一致。这些差异可能部分反映抗营养因子（ANF）含量的变化，其可受豌豆品种和加工条件影响。本研究中，素食餐含有显著高于杂食餐的膳食纤维和ANF，可能由于其较高比例的全植物成分。这些化合物已知通过抑制消化酶和形成限制肠道蛋白水解的蛋白质复合物来降低蛋白质消化率。因此，素食餐较杂食餐略微但持续降低了豌豆蛋白和大多数氨基酸的消化率。研究发现餐型不影响空肠肽和氨基酸转运体表达，表明较低消化率源于腔内消化受损而非肠道吸收改变。尽管年龄单独未对豌豆蛋白消化率产生有意义影响，但素食餐诱导的降低在老年大鼠中更为明显。这一发现与Gilani等一致，其报道衰老主要降低低质量蛋白质来源（如豆类）的粪便消化率，而高度可消化的动物蛋白大多不受影响。这表明年龄相关的消化功能损害，如酶活性降低和肠道运动减慢，可能通过限制蛋白质水解而加剧植物源性成分（即ANF和纤维）对蛋白质消化的抑制作用。本研究中，豌豆蛋白的高消化率可能解释了年龄主效应的缺失。与先前发现一致，衰老与肽和氨基酸转运体表达的逐渐增加相关，同时紧密连接蛋白表达更高，表明肠道屏障的适应性反应以在年龄相关生理变化下保持营养吸收。同时，黏蛋白基因表达增加可能反映对富含苏氨酸黏蛋白的更大需求，从而促成老年大鼠中观察到的更高内脏滞留。然而，如果这种上调也导致更大黏蛋白产生，更厚的黏液层可能限制营养物质接近上皮表面并降低蛋白质消化效率。这一机制可能解释为何素食餐在老年大鼠中诱导豌豆蛋白和氨基酸消化率更大降低。尽管存在这一适度但持续的降低，素食餐未改变餐后氮分配或蛋白质合成率，表明吸收后氮处理得以保持。相反，发育阶段显著影响膳食氮的代谢命运。年轻大鼠表现出更高的豌豆源性氮掺入腓肠肌、更高的肌肉蛋白质合成率以及较低的膳食氮向血浆和尿液尿素转移，与成年和老年大鼠相比。这些发现与先前报道年轻大鼠肌肉蛋白质合成率较高以及年轻（2月龄）较成年（11月龄）大鼠氨基酸脱氨基作用较低的研究一致。这反映了与生长相关的更大合成代谢需求。相反，成年和老年大鼠表现出独特的膳食氮利用特征，在外周水平表现为豌豆氮掺入腓肠肌减少和肌肉蛋白质合成率降低。成年和老年大鼠腓肠肌的转录谱与其较低的肌肉合成代谢活性一致。Trib3、Ulk1和eIF-2α表达增加与肌肉萎缩、mTOR信号抑制、自噬促进和蛋白质合成降低相关，表明成熟大鼠肌肉向较低合成代谢信号和较高蛋白质周转转变。同时，成年和老年动物表现出更高的豌豆源性氮掺入肝脏和血浆蛋白。这些结果与先前观察到的成年或老年个体较年轻个体增强的膳食氨基酸内脏利用一致。成年和老年大鼠肝脏氮滞留增加与更高的肝脏蛋白质合成相关，如先前报道，并与肝脏Atf4、Ddit3和Trib3表达降低相关，表明GCN2介导的翻译抑制和自噬减少，从而有利于蛋白质合成。更大的内脏滞留还伴随氨基酸脱氨基作用增加，反映为成年和老年大鼠更高的尿素产生，如先前报道。总体而言，这些发现表明氮利用从年轻大鼠的生长导向模式转向成年和老年大鼠的维持导向代谢。这种模式可能随年龄增长更为明显。确实，内脏区域对膳食氨基酸的优先隔离和利用以及外周合成代谢反应性降低已在老年人类中报道。在大鼠中，虽然老年大鼠（24月龄）较成年大鼠（3月龄）内脏提取增加已有报道，但肌肉蛋白质合成在成年和老年大鼠（22至24月龄）之间通常无差异。本研究中，成年和老年大鼠之间餐后氮利用和肌肉合成代谢反应未观察到重大差异。本研究有几个优势和局限性应予承认。优势包括纳入三个不同生命阶段，提供了跨生命周期（从青少年生长到早期衰老）年龄相关蛋白质代谢变化的原创且更全面的视角，而大多数研究通常限于两组。此外，¹⁵N标记的使用使研究人员能够特异性追踪豌豆源性氮的代谢命运。素食餐也使用植物性膳食中常见的微加工成分设计，从而增强了模型的生理相关性。然而，应考虑几个局限性。一个局限性是使用口腔-盲肠消化率作为回肠消化率的代理。尽管该方法已被FAO/IAEA专家组认为适合评估大鼠氨基酸消化率，但盲肠中的微生物代谢可能改变消化物的氨基酸组成，从而影响估计的消化率值。因此，绝对氨基酸消化率值应谨慎解释。然而，粪便氮消化率和盲肠氨基酸消化率之间观察到效应的一致性支持组间差异的相关性。另一个局限性是使用在大鼠中相对消化良好的豌豆蛋白可能减弱了潜在差异，使用消化率较低的蛋白质来源可能观察到更强的效应。此外，老年组（18个月）可能代表Wistar大鼠衰老的早期阶段，可能限制检测更明显的年龄相关损害。尽管该年龄根据生命阶段分类对应于成年晚期，但仍处于肌少症前阶段，肌少症通常发生在约24月龄。尽管如此，这些动物显示出衰老的早期标志物，包括食物摄入减少、体重增加降低和肌肉质量减少，与先前发现一致，表明生理衰老的开始但非晚期衰老。最后，研究仅在雄性大鼠中进行，不能排除性别特异性反应。

研究结论部分翻译：总之，本研究为植物性膳食背景如何影响豌豆蛋白在不同年龄段的消化和代谢命运提供了新见解。素食餐略微但持续降低了蛋白质和平均氨基酸消化率，在老年大鼠中观察到更明显的降低。然而，这种较低的消化率并未转化为餐后氮分配或蛋白质合成率的重大变化。年龄也成为餐后蛋白质代谢的关键决定因素，年轻大鼠优先将膳食氨基酸导向肌肉沉积，而成年和老年大鼠表现出更高的内脏滞留和氨基酸分解代谢。总体而言，这些发现表明均衡的植物性膳食可支持整个生命周期的餐后蛋白质代谢，尽管对衰老过程中的蛋白质消化率影响更大。需要进一步的长期研究以确定这些在消化率中观察到的适度差异是否随时间累积并影响年龄相关结局，如肌肉质量维持和合成代谢反应性。