《Journal for Nature Conservation》：Karst cryptobiodiversity unveiled: eDNA reveals a hidden refuge for endemic fish
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Konavle雅罗鱼（Telestes miloradi Bogutskaya, Zupan?i?, Bogut & Naseka, 2012）是一种极度濒危的淡水鱼类，为克罗地亚南部狭域特有種，由于栖息地丧失和入侵物种的影响，被认为濒临灭绝。研究人员将传统电
Konavle雅罗鱼（Telestes miloradi Bogutskaya, Zupan?i?, Bogut & Naseka, 2012）是一种极度濒危的淡水鱼类，为克罗地亚南部狭域特有種，由于栖息地丧失和入侵物种的影响，被认为濒临灭绝。研究人员将传统电捕鱼与两种互补的环境DNA（eDNA）方法——一种新型qPCR检测法和eDNA宏条形码（metabarcoding）——相结合，评估其在Konavosko Polje七个采样点的当前状况。电捕鱼仅在单一地点捕获4尾幼鱼，而两种eDNA方法在所有七个调查点均检测到T. miloradi。qPCR检测法对Telestes sp.展现出高灵敏度，但体外试验（in-vitro tests）揭示其可能与T. metohiensis和T. dabar发生交叉扩增（cross-amplification）。然而，研究区域内已知仅分布有T. miloradi，限制了该交叉扩增的影响。宏条形码同样无法区分这三个物种，但提供了关于鱼类群落组成的额外信息，揭示其与多种特有種和入侵物种共存。这些发现证实了T. miloradi在其历史分布范围内的持续存在，可能采用地下避难所策略，并证明了eDNA作为灵敏、非侵入性工具在监测难以发现的淡水物种方面的价值。研究人员建议将基于eDNA的调查纳入所有第纳尔喀斯特（Dinaric Karst）及其他喀斯特特有種的长期保护策略中。
研究背景：淡水生态系统在全球生物多样性中占据关键地位，以不足1%的地球表面积承载了近10%的已知物种。然而，自1970年以来淡水生物多样性下降了84%，近三分之一的物种面临灭绝威胁。巴尔干半岛，尤其是第纳尔喀斯特地区，被公认为全球生物多样性热点和淡水保护优先区域。该区域年轻的地质结构、独特的地理屏障和破碎化的水文网络促进了特有種和狭域特有種的演化。喀斯特溶蚀洼地（polje）是第纳尔喀斯特的标志性特征，其岩溶作用导致河流流量模式改变、间歇性河流和伏流发育以及地下水位上升，这些过程可能通过物种隔离促进了异域物种形成。然而，该区域鱼类种群常局限于狭小区域、种群规模小，且面临栖息地改变、水抽取、污染和非本土物种引入等多重压力。传统调查方法如电捕鱼在喀斯特系统中效率有限，因为种群可能占据短暂的地表河段、在不利条件下退入地下、通过隐蔽通道扩散，或以极低密度存在而难以可靠捕获。因此，研究人员需要发展灵敏、非侵入性的监测工具来评估这些隐秘物种的分布与生存状况。Konavle雅罗鱼（T. miloradi）是仅分布于克罗地亚南部Konavosko Polje的狭域特有種，曾被认为已灭绝，2013年重新发现后其已知分布仅限于Dragi? Potok溪流的少数地点。该物种于2023年被IUCN红色名录评估为极度濒危（B2ab(iii)），主要威胁包括严重的栖息地改变与退化、农业污染以及非本土鱼类（主要为虹鳟Oncorhynchus mykiss和黑鲶Ameiurus melas）的引入。此前电捕鱼调查曾检测到T. miloradi，但该方法对于可能利用地下溪流和水体的个体检测效率低下。因此，研究人员开展了这项研究，旨在通过结合传统电捕鱼与分子方法（包括靶向qPCR和eDNA宏条形码）来更新T. miloradi在Konavle地区的分布现状，并表征鱼类群落组成、评估入侵物种的潜在存在以及利用生物多样性指数评价采样点的生态状况。
主要关键技术方法：研究人员在Konavosko Polje选取7个eDNA采样点，于2022年3月至11月高水位期间采集水样，现场过滤（3–6 L/重复，三重复），滤膜保存于99%分子级乙醇中。eDNA提取采用改良的Macherey-Nagel NucleoSpin Tissue试剂盒方案。设计针对T. miloradi细胞色素b基因（cytb）85 bp片段的物种特异性引物和探针，进行qPCR检测（优化条件为引物1 μM、探针400 nM、退火温度62°C），每站9个技术重复。同时使用MiFish通用鱼类引物扩增12S rRNA基因175 bp片段进行eDNA宏条形码分析，产物在Illumina NextSeq 2000平台测序。生物信息学分析采用DADA2流程处理测序数据，mothur软件进行分类指派。此外，2019至2023年间在8个站点开展8次电捕鱼调查作为传统方法对照，并采集一尾T. miloradi鳍条样本用于DNA分析。研究获得了克罗地亚环境保护与能源部及农业部的相关研究许可。
研究结果：
3.1 eDNA生物评估
3.1.1 检测法的验证：qPCR在引物1 μM、探针400 nM、退火温度62°C条件下获得最优扩增效果。计算机模拟（in-silico）和体外试验均显示与共存非靶标物种无交叉扩增风险。然而，in-silico分析预测可能扩增近缘种T. dabar和T. metohiensis，靶标片段上引物和探针均无错配。体外试验证实了这一点，T. metohiensis DNA在低至2×10?? ng/μL时仍可扩增（平均Ct = 36.9 ± 0.5），T. dabar在低至2×10?1 ng/μL时可扩增（平均Ct = 37.3 ± 0.9）。该检测法对T. miloradi展现出高灵敏度，在所有测试浓度（20 ng/μL至2×10?? ng/μL）均成功扩增，Ct值为16.6 ± 0.1至39.2 ± 0.3。宏条形码分析中指派为Telestes sp.的reads计数与qPCR Ct值显著相关（t = -3.40, R2 = 0.41, p < 0.01），reads计数越高对应Ct值越低。
3.1.2 T. miloradi的检测：两种eDNA方法（qPCR和宏条形码）在所有七个采样点均检测到Konavle雅罗鱼，而电捕鱼仅在单一站点（Dragi? Potok，站点7）捕获4尾幼鱼。qPCR在所有采样点检测到Telestes sp.，平均Ct值范围为35.6 ± 1.8（Zastolje）至37.0 ± 2.8（Ljuta Spring）。宏条形码在16个样本中共产生1,703,684条reads（平均每站点212,961 ± 192,295条reads）。Telestes sp. reads在所有站点均被检出，范围从7,228条（Dragi? 2，站点6）至159,545条（Ljuta spring，站点3），平均每站点58,094 ± 51,916条reads。
3.2 基于eDNA宏条形码的鱼类群落组成：Telestes sp.在所有eDNA采样点均被检测到，并在Konavo?ica（87.4%）、Ljuta（60.3%）和Kopa?ica Sink（53.6%）的群落中占据优势，导致这些站点Simpson生物多样性指数最低（分别为0.30、0.64、0.71）。Ljuta样本中Salmo trutta丰度显著（18.3%）。Zastolje群落以本土種Scardinius plotizza（56.8%）和Delminichthys ghetaldii/adspersus（24.7%）为主，Simpson指数为0.67。Konavo?ica的Shannon指数也最低（0.69），而其他站点群落更为均衡，Shannon指数较高（如Ljuta为1.73，Kopa?ica Sink为2.05，Zastolje为1.59）。Dragi? Potok群落多样性最高（Shannon指数2.58；Simpson指数0.87），以非本土虹鳟（O. mykiss，31%）为主。Kopa?ica Lateral Canal和Dragi? 2呈现中间模式，群落分别以S. trutta（56.1%）和Squalius sp.（44%）为主，生物多样性指数适中（Simpson指数分别为0.76和0.82，Shannon指数分别为1.86和1.94）。虽然Bray-Curtis相异度与站点间地理距离无显著相关性（Mantel统计量：-0.02；p = 0.49），但结果显示以Telestes sp.为主的站点（Konavo?ica、Ljuta和Kopa?ica Sink）存在弱聚类模式。
讨论部分总结：研究人员讨论了T. miloradi的状况，指出该物种曾长期被认为已灭绝，但本研究通过eDNA在多个站点的高置信度检测证实了其在其已知分布范围内的持续存在。电捕鱼与eDNA检测结果之间的差异最好由季节性利用地下避难所的策略来解释，这种行为在其他第纳尔鲤科鱼类中已有描述。地下避难所的范围可能受该区域地下洞穴、虹吸湖和落水洞的发育程度、尺寸和深度影响。eDNA为T. miloradi的有效长期监测提供了可靠证据。关于Telestes属内的遗传近缘性，研究人员指出由于T. miloradi、T. dabar和T. metohiensis在cytb和12S rRNA片段上的高度相似性，区分这三个物种具有挑战性。近期系统发育分析报道T. dabar与T. miloradi之间p距离极低（3%），T. miloradi与T. metohiensis之间类似，而T. metohiensis与T. dabar之间仅0.9%分歧。这些物种共享一个共同祖先，其分布曾包括Neretva和Ljuta河流，并在上新世末至中更新世之间近期分化。尽管线粒体标记无法完全区分T. miloradi与其近缘种，但这一局限不影响研究结论，因为这些近缘种的分布范围地理上相距遥远且与水系隔离。这强调了未来eDNA研究的一个重要观点：短线粒体片段在近期分化的谱系内可能缺乏分辨率，但当结合生物地理背景时，仍可保持高度的物种检测可靠性。关于Konavosko Polje鱼类群落组成，宏条形码揭示了物种丰富的鱼类群落，包括多种具有高保护价值受威胁的本土鱼类。欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）、Neretva雅罗鱼（S. svalize）和南达尔马提亚鱥（D. ghetaldii）的检测证实了列入Natura 2000的物种在该区域的持续存在。研究还检测到入侵和移植物种，部分相对丰度较高。虹鳟和鲤鱼因水产养殖被引入Konavosko Polje但常逃逸，这些物种可通过栖息地改变和捕食对引入区域产生负面影响，加强了对非本土鱼类种群进行积极管理的必要性。两种eDNA方法均证实T. miloradi在所有采样点存在，且在与地下系统水文连接的站点（Konavo?ica、Ljuta和Kopa?ica Sink）占据群落优势。尽管eDNA无法提供可靠的丰度估计，但可以确认物种存在并补充传统调查。关于喀斯特系统本土淡水鱼类的未来展望，研究人员指出鉴于T. miloradi的估计占有面积低于8 km2，且Konavosko Polje还支持其他具有保护价值的本土鱼类和受威胁特有種，该喀斯特溶蚀洼地应被视为保护优先区域。鉴于地下栖息地对T. miloradi持续存在的重要性，保护工作应明确包括地下含水层的保护和水文连通性的维持。综合管理策略应结合退化栖息地的恢复、对已建立入侵鱼类种群的评估和控制（在生态学上合理时）以及通过适当管理措施防止进一步引入。长期eDNA监测可以补充这些行动，跟踪鱼类群落组成和分布的变化，帮助评估保护行动的有效性。在Konavosko Polje之外，研究结果表明类似的联合方法（靶向qPCR与宏条形码结合）可适用于其他第纳尔喀斯特系统，其中窄域分布的淡水鱼类难以用传统实地方法检测。
研究结论翻译：研究人员证实了极度濒危的Konavle雅罗鱼（Telestes miloradi）在Konavosko Polje所有调查站点持续存在，尽管传统电捕鱼几乎无法检测到该物种。研究还表明，两种eDNA方法（qPCR和宏条形码）在监测这种难以发现的喀斯特适应物种方面远比传统方法有效。 beyond这一核心发现，研究工作展示了结合靶向和群落水平eDNA方法的力量：qPCR检测法提供了高度灵敏的物种特异性检测，而宏条形码揭示了更广泛的群落组成，包括受威胁的本土鱼类和入侵物种。这种综合方法不仅增强了物种存在的置信度，还将T. miloradi置于其生态背景中，突出了非本土分类群构成的威胁。该研究代表了eDNA首次全面应用于一种极度濒危的巴尔干鲤科鱼类，并提供了可直接适用于其他第纳尔喀斯特特有種的方法学框架。通过证实T. miloradi的存活，研究挑战了其灭绝的假设，并强调小型、隔离的淡水物种在传统调查失败时可能未被检测地持续存在。多个站点eDNA检测的一致性，加上严格的对照，支持了结果的稳健性，并回应了关于假阳性或错误鉴定的担忧。总之，研究表明eDNA是记录物种持续存在、指导保护和制定喀斯特系统淡水生物多样性管理策略的强大工具。保护T. miloradi不仅将防止一个独特谱系的丧失，而且如果保护措施扩展到地表栖息地之外，包括对 underlying含水层系统及其水文连通性的保护，还将保障Konavosko Polje——欧洲最受威胁的淡水景观之一——更广泛的生物多样性。
