引言
羟基酸和酮基酸是碳代谢中的核心中间体，参与糖酵解、三羧酸（TCA）循环、脂肪酸氧化以及氨基酸分解代谢，以维持细胞能量的稳态[[1], [2], [3]]。丙酮酸和乳酸是关键的代谢节点，通过乳酸/丙酮酸穿梭作用将细胞质中的糖酵解与线粒体氧化联系起来，并将碳传递到TCA循环中[[4], [5], [6]]。除了作为中间代谢物的作用外，一些羟基酸还表现出信号分子的功能，调节细胞代谢过程[1,7,8]。例如，乳酸、3-羟基丁酸（3-HB）和2-羟基戊二酸（2-HG）作为调节性代谢物，具有独特的信号传导和染色质修饰活性[[9], [10], [11], [12]]。这些功能包括乳酸诱导的组蛋白乳酸化[13]、3-HB介导的组蛋白去乙酰化及β-羟基丁酰化[14,15]，以及2-HG依赖的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶抑制[16]，从而凸显了羟基酸和酮基酸在传统代谢功能之外的多样化调控作用。
在羟基酸和酮基酸中，支链酮基酸（BCKAs）是由支链氨基酸（BCAAs；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）通过转氨作用生成的，是一类与线粒体功能和代谢紊乱密切相关的重要代谢物[17]。BCAA代谢的改变与肥胖和胰岛素抵抗有很强的相关性[[18], [19], [20]]。2型糖尿病患者体内的BCAA及其相应酮基酸水平也有所升高。这些代谢异常通常与支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）活性降低和线粒体分解代谢受损有关[[21], [22], [23]]。此外，酮基酸与其相应羟基酸之间的可逆转化反映了细胞内的氧化还原状态和代谢流，为代谢重构提供了重要信息[[24], [25], [26], [27]]。因此，同时定量羟基酸/酮基酸对对于全面评估碳代谢和氧化还原相关的代谢调控至关重要。
尽管羟基酸和酮基酸具有生物学意义，但对其的全面定量分析在分析上仍然具有挑战性。这些代谢物极性高，在传统的反相液相色谱（LC）系统中的保留能力有限，且在生物基质中的浓度分布范围较广。将化学衍生化技术与质谱（MS）结合使用，已被广泛用于提高短链脂肪酸、羟基酸相关代谢物和酮基酸的保留和检测能力[[28], [29], [30]]。最近，扩展的LC-MS工作流程使得能够更广泛地覆盖酮体、α-酮酸、乳酸、丙酮酸和含羧基的代谢物[[31], [32], [33]]。已经开发了多种针对羧基的衍生化试剂，以提升LC-MS的性能，包括用于含羧基代谢物同位素编码分析的二甲氨基苯酰溴[34]、用于含羧基代谢物同位素标记和半定量分析的2-吡蔻胺[35]，以及用于醛类和羧酸靶向衍生化的4-APEBA[36]。这些研究表明了现有标记策略的多样性及其利用质谱提高有机酸检测能力的潜力。
由于羟基酸和酮基酸都含有羧基，因此选择合适的羧基导向衍生化试剂原则上可以同时分析这两类代谢物。然而，使用某种试剂的分析性能取决于其化学性质和具体分析物的特性[[29], [30], [31], [37]]。特别是酮基酸还含有额外的羰基，可以通过进一步的化学修饰提供额外的结构信息并提高MS检测能力。准确的定量分析还需要适当的内标化，以最小化分析误差。尽管广泛使用特定分析物的稳定同位素标记内标，但其成本和供应限制了其在广泛代谢物分析中的应用。因此，使用13C6-3-NPH衍生的内标进行化学同位素标记成为另一种策略，如用于短链脂肪酸定量的方法，以及使用丹磺酰肼进行羧基亚代谢组分析的差异同位素标记[28,33]。这些方法为将同位素信息整合到衍生化代谢物中提供了可靠的方法，无需单独合成每个分析物的同位素标记类似物。
虽然LC-MS相比基于气相色谱的方法[31,[37], [38], [39], [40]]在与复杂生物样本的兼容性方面有所改进，但对于结构相似的极性代谢物的可靠区分和定量仍然具有挑战性。因此，结合互补的功能基团标记、灵敏的LC-MS/MS检测和同位素编码内标化的分析策略可能为全面分析羟基酸和酮基酸提供额外的优势。
在这里，我们开发了一种正交化学编码的LC-MS/MS策略，通过结合羰基选择性的PFBHA标记和羧基导向的3-硝基苯肼（3-NPH）衍生化，实现对羟基酸和酮基酸的定量分析。利用酮基酸的额外羰基功能，这种顺序策略引入了互补的化学特征，提高了酮基酸的检测能力，同时保持了广泛的羟基酸覆盖范围。基于已建立的化学同位素标记方法，我们将13C6-3-NPH衍生的内标纳入正交衍生化工作流程，支持定量分析，而无需为每个分析物单独准备同位素标记内标。该方法通过LC-MS/MS进行了系统验证，包括与特定分析物的同位素标记内标的比较，并进一步应用于糖尿病小鼠的血清样本，以表征复杂生物基质中的羟基酸和酮基酸的变化。
