《International Journal of Molecular Sciences》：TRIM26-Mediated Ubiquitination and Degradation of DDRGK1 Suppress NSCLC Progression by Inhibiting DNA Repair and Promoting Apoptosis
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非小细胞肺癌（NSCLC）的高发病率和不良预后凸显了阐明其进展和化疗耐药分子机制的迫切需求。本研究探讨了含DDRGK域蛋白1（DDRGK1）在NSCLC中的作用，并鉴定了一条调控其蛋白稳定性的新型调节轴。临床方面，DDRGK1在NSCLC组织中显著上调，DDR
非小细胞肺癌（NSCLC）的高发病率和不良预后凸显了阐明其进展和化疗耐药分子机制的迫切需求。本研究探讨了含DDRGK域蛋白1（DDRGK1）在NSCLC中的作用，并鉴定了一条调控其蛋白稳定性的新型调节轴。临床方面，DDRGK1在NSCLC组织中显著上调，DDRGK1表达升高与晚期肿瘤分期、较差的总生存期和化疗耐药相关。功能方面，DDRGK1敲除显著抑制NSCLC细胞生长，该效应可被DDRGK1重新表达所逆转。机制方面，含三联基序蛋白26（TRIM26）被鉴定为催化DDRGK1在K267位点发生K48连接多泛素化并促进其降解的E3泛素连接酶。该修饰拮抗E3 UFM1蛋白连接酶1（UFL1）介导的同一残基上的UFMylation，从而精细调控DDRGK1稳定性。功能富集分析显示，DDRGK1相互作用蛋白及DDRGK1敲除细胞中差异表达蛋白主要与DNA损伤应答和凋亡相关。与此一致，DDRGK1敲除抑制ATR磷酸化并增强顺铂诱导的NSCLC细胞凋亡。总之，这些发现阐明了DDRGK1的调控机制，确立其为NSCLC进展的关键调控因子，并突出其作为克服化疗耐药治疗靶点的潜力。
研究背景方面，肺癌约占全球癌症死亡的五分之一（GLOBOCAN 2024），其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%，近70%的患者在局部晚期或转移阶段才被诊断。靶向治疗依赖驱动基因突变，免疫治疗单药应答率低，铂类化疗仍是不可或缺的手段，但约50%的晚期NSCLC患者对顺铂为基础的治疗存在内在耐药，因此阐明化疗耐药机制对改善预后至关重要。泛素及泛素样修饰在NSCLC进展中发挥重要作用，E3泛素连接酶决定底物特异性。TRIM26是TRIM家族RING型E3泛素连接酶，其作用具有底物依赖性和情境特异性。UFMylation是一种新型泛素样修饰，由E1酶UBA5、E2酶UFC1和唯一E3连接酶UFL1催化。DDRGK1是内质网驻留衔接蛋白，可将UFL1锚定于内质网膜，参与内质网稳态、核糖体相关质量控制及基因毒性应激应答，并可稳定p53、参与ATM激活。DDRGK1在骨肉瘤中过表达并介导化疗耐药，但其在NSCLC中的临床相关性尚未确立。本研究旨在探索DDRGK1在NSCLC中的作用及调控机制。研究人员发现DDRGK1蛋白在NSCLC中显著上调并与不良预后相关；TRIM26介导DDRGK1 K267位点K48连接泛素化并促其降解，与UFL1介导的同一残基UFMylation相拮抗；DDRGK1敲除削弱ATR磷酸化并增强顺铂诱导的凋亡。该研究确立了DDRGK1的调控机制，并提示其作为NSCLC治疗靶点的潜力。技术方法方面，研究人员采用基于SFB标签的串联亲和纯化联合质谱（TAP-MS）鉴定DDRGK1相互作用蛋白，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定泛素化与UFMylation位点；采用CRISPR/Cas9构建DDRGK1、UFL1及UFSP2敲除细胞系；采用GST pull-down、免疫共沉淀（Co-IP）、体内外泛素化及UFMylation实验、环己酰亚胺（CHX）追踪实验评估蛋白互作与稳定性；采用实时细胞分析（RTCA）迁移实验、软琼脂克隆形成、CCK8活力检测、平板克隆形成、Annexin V-FITC/PI流式凋亡检测及裸鼠皮下移植瘤模型进行功能验证；并基于癌症基因组图谱（TCGA）、临床蛋白质组肿瘤分析联盟（CPTAC）及DepMap数据库进行生物信息学分析，所用组织芯片为商业购买的人肺腺癌（LUAD）组织芯片（含80例LUAD与80例正常肺组织）。
研究结果方面，2.1 DDRGK1蛋白在NSCLC患者中显著上调并加速NSCLC进展：通过TCGA与CPTAC数据库分析及组织芯片免疫荧光发现DDRGK1 mRNA无显著差异而蛋白在LUAD/LUSC中显著上调，高表达与晚期分期、转移、较差总生存期及化疗后不良生存相关。2.2 DDRGK1促进NSCLC细胞生长：通过CRISPR/Cas9敲除结合RTCA迁移、软琼脂克隆形成及裸鼠移植瘤实验，发现DDRGK1敲除抑制迁移、非锚定依赖生长与成瘤能力，重新表达可逆转上述表型。2.3 DDRGK1发生K48连接泛素化及蛋白酶体降解：通过MG132与HCQ处理、变性条件下泛素化实验及链特异性抗体检测，发现DDRGK1主要经蛋白酶体途径降解并主要发生K48连接多泛素化；TAP-MS鉴定出TRIM25与TRIM26为共有E3连接酶，Co-IP证实二者均与DDRGK1互作，但仅TRIM26促进其K48连接泛素化。2.4 TRIM26是DDRGK1的真正E3连接酶：通过免疫荧光共定位、内源性Co-IP、GST pull-down及截短突变体实验，证实DDRGK1与TRIM26直接互作，TRIM26的SPRY结构域（aa 365–539）与DDRGK1的PCI结构域为结合关键区域；TRIM26以剂量依赖方式增强DDRGK1 K48连接泛素化，野生型而非酶失活突变体（TRIM26C16/19A）或结合缺陷突变体（TRIM26RBC）可促进该修饰，TRIM26敲低降低内源性DDRGK1 K48泛素化，过表达加速DDRGK1更新。2.5 TRIM26与UFL1竞争结合DDRGK1，促进K267位点泛素化及降解：通过LC-MS/MS鉴定出K107、K116、K170、K191、K227、K267为泛素化位点，仅K267R突变削弱TRIM26介导的泛素化并延长DDRGK1半衰期，癌症相关突变K267M同样降低泛素化；K267亦为UFMylation关键位点，K267R显著削弱UFSP2敲除细胞中DDRGK1的UFMylation；UFL1敲除降低DDRGK1蛋白量并可被MG132而非HCQ逆转，UFL1缺失增加内源性DDRGK1 K48泛素化；UFL1与UFM1共表达减弱TRIM26介导的泛素化，而TRIM26与泛素共表达降低UFL1介导的UFMylation；竞争结合实验显示UFL1与TRIM26相互减弱对方与DDRGK1的结合。2.6 DDRGK1敲除抑制ATR信号并促进顺铂诱导的凋亡：通过对HCIPs及差异表达蛋白的GO/KEGG富集分析发现DNA修复通路显著富集，质谱与Co-IP证实DDRGK1与ATR互作；顺铂处理后DDRGK1敲除细胞中p-ATR、p-CHK1及γH2AX水平降低，时程实验显示早期（2 h）γH2AX与p-ATR(T1989)积聚受抑；DIA定量蛋白质组学显示差异蛋白富集于DNA损伤相关的内源性凋亡通路，促凋亡蛋白升高，cleaved caspase-3增加，流式凋亡率升高；CCK8与平板克隆实验显示DDRGK1敲除降低细胞活力与克隆存活并增强顺铂抑制作用，裸鼠移植瘤实验显示DDRGK1敲除增强顺铂对肿瘤生长的抑制。此外，通过K267R回补实验发现K267R不能恢复顺铂诱导的ATR磷酸化，且其抗凋亡恢复能力弱于野生型，提示K267 UFMylation对DDRGK1支持ATR信号的功能具有重要性。
讨论部分总结：DDRGK1在NSCLC中主要在蛋白水平受调控，TCGA与CPTAC转录本无显著差异而蛋白显著升高，提示其蛋白稳定性受严格调控；本研究证实其经泛素-蛋白酶体途径降解，并通过TAP-MS鉴定TRIM26为直接介导K48连接泛素化与降解的E3连接酶；K267同时受TRIM26依赖的泛素化与UFL1依赖的UFMylation修饰，构成同一残基上的竞争性修饰，且UFL1与TRIM26在PCI结构域存在结合竞争；K267是目前明确记录的泛素化与UFMylation定位于同一赖氨酸并相互竞争的例证之一，但切换的上游信号尚不清楚；TRIM26与DDRGK1在CPTAC-LUSC中呈弱正相关，提示TRIM26对DDRGK1的降解可能依赖其活性而非蛋白丰度；DDRGK1敲除削弱早期γH2AX与p-ATR/p-CHK1诱导，提示DNA损伤信号受损，但DDRGK1如何调控ATR活性及DNA损伤定量的机制仍需进一步实验；由于DDRGK1为内质网驻留膜锚定蛋白，其作用于核内ATR可能为间接方式；K267位于C端PCI结构域，UFMylation可能作为构象与互作开关，K267R突变削弱UFMylation及UFL1-DDRGK1互作，且K267 UFMylation更像应激与组织特异性的放大器而非简单开关。研究结论部分翻译：DDRGK1蛋白在NSCLC中上调并与不良预后相关。DDRGK1水平受TRIM26介导的泛素化调控，TRIM26与UFL1竞争结合DDRGK1，促进K267位点泛素化及随后的降解。DDRGK1敲除降低ATR磷酸化并在体外和体内增强顺铂诱导的NSCLC细胞凋亡。
