《Cancers》：Senescence-Related Transcriptomic Analysis and Functional Characterization of ANGPTL4 in Lung Adenocarcinoma
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背景：细胞衰老及衰老相关分泌表型（SASP）可改变肿瘤细胞与周围微环境之间的通讯，但参与该过程的细胞外介质在肺腺癌（LUAD）中仍知之甚少。方法：采用批量转录组分析表征衰老相关转录改变并构建预后特征。在公共数据集和临床样本中评估ANGPTL4表达。随后进行单细
背景：细胞衰老及衰老相关分泌表型（SASP）可改变肿瘤细胞与周围微环境之间的通讯，但参与该过程的细胞外介质在肺腺癌（LUAD）中仍知之甚少。方法：采用批量转录组分析表征衰老相关转录改变并构建预后特征。在公共数据集和临床样本中评估ANGPTL4表达。随后进行单细胞RNA测序分析，以绘制LUAD细胞群中衰老相关基因集评分并检查细胞间通讯。利用ANGPTL4敲低和过表达评估其对LUAD细胞增殖、迁移及SA-β-gal阳性率的影响，同时采用皮下异种移植模型检查体内肿瘤生长。进行条件培养基和间接共培养实验，以评估过表达ANGPTL4的LUAD细胞对THP-1来源巨噬细胞炎症反应的影响，并使用MCC950评估NLRP3相关信号的贡献。结果：LUAD中的衰老相关转录改变富集于炎症和免疫相关通路。ANGPTL4被纳入一个五基因预后模型，并因其编码分泌蛋白而被选用于功能研究。研究发现LUAD组织中ANGPTL4蛋白水平升高。单细胞分析显示巨噬细胞富集群体中衰老相关基因集评分相对较高，且在高评分组中细胞间通讯更强。ANGPTL4敲低降低LUAD细胞迁移和SA-β-gal阳性率，而其过表达则产生相反效应并导致更大的异种移植肿瘤。条件培养基和间接共培养实验显示，过表达ANGPTL4的LUAD细胞诱导THP-1来源巨噬细胞的炎症改变，伴随NLRP3相关标志物和IL-1β分泌增加。这些改变被MCC950部分减弱。结论：这些发现提示ANGPTL4与LUAD中肿瘤细胞-巨噬细胞交互作用相关，并可能与衰老相关转录特征相关，而ANGPTL4的具体生物学作用仍有待进一步表征。
研究背景方面，肺癌仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的组织学亚型。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂取得进展，治疗耐药和疾病进展仍是LUAD的主要挑战。恶性肿瘤细胞与周围基质及免疫群体之间的相互作用参与LUAD生物学过程，肿瘤相关巨噬细胞是肺癌微环境中丰富且高度可塑的组分，可影响肿瘤生长、侵袭、血管生成和抗肿瘤免疫。细胞衰老与上述交互作用相关，因为其既可改变细胞增殖，也可改变作用于邻近细胞的因子分泌。衰老细胞可保持代谢活跃并形成衰老相关分泌表型（SASP），SASP因子包括细胞因子、趋化因子、生长因子和基质重塑分子。单细胞研究已揭示肺肿瘤中多样的髓系群体，凸显了在特定细胞区室中检查炎症特征的必要性。血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）是一种分泌型糖蛋白，参与脂质代谢、血管通透性和组织重塑，并已被牵涉于肿瘤细胞存活、血管渗漏和侵袭。新兴研究还将ANGPTL4与NSCLC进展、代谢适应、转移和治疗耐药相关联。然而，ANGPTL4与LUAD衰老相关状态之间的关系尚未明确建立，过表达ANGPTL4的LUAD细胞是否改变巨噬细胞炎症反应仍不清楚，因此研究人员开展了本项研究。研究人员整合批量与单细胞转录组分析、临床样本评估和功能实验，利用衰老相关预后模型将ANGPTL4优先用于进一步研究，检查了ANGPTL4敲低和过表达对LUAD细胞增殖、迁移和SA-β-gal阳性率的影响，评估了ANGPTL4过表达后的异种移植生长，并利用条件培养基和间接共培养实验检测巨噬细胞对过表达ANGPTL4的LUAD细胞的反应，使用MCC950检查NLRP3信号的贡献。研究结论提示ANGPTL4与LUAD中肿瘤细胞-巨噬细胞交互作用相关，并可能与衰老相关转录特征相关，而ANGPTL4的具体生物学作用仍有待进一步表征，这些发现支持对ANGPTL4相关肿瘤-免疫交互作用开展进一步研究。
关键技术方法方面，研究人员从SenMayo获取衰老相关基因集，批量RNA-seq数据来源于TCGA-LUAD和六个GEO队列（GSE13213、GSE26939、GSE30219、GSE31210、GSE42127、GSE50081），单细胞RNA测序数据来源于人类基因组序列档案库（GSA-Human；登录号HRA002509）；使用sva和Harmony进行批次效应校正。采用单因素Cox回归联合LASSO-Cox回归构建多基因预后特征，并通过Kaplan–Meier分析和ROC曲线评估。利用GSVA和GSEA进行富集分析，通过IPS和TIDE评分预测免疫治疗反应，采用pRRophetic估计药物半数抑制浓度（IC50），并使用七种反卷积算法联合ESTIMATE算法评估肿瘤微环境。单细胞数据经Seurat处理、Harmony校正后行PCA、图聚类和UMAP可视化，采用AUCell、UCell、singscore、AddModuleScore和ssGSEA五种方法计算衰老相关转录评分，使用inferCNV推断上皮细胞拷贝数谱，使用CellChat推断配体-受体网络。细胞实验采用siRNA转染和慢病毒转导实现ANGPTL4敲低与过表达，通过RT-qPCR和Western blotting验证效率，并开展CCK-8、集落形成、伤口愈合、Transwell迁移、SA-β-gal染色和EdU增殖实验。收集条件培养基，将THP-1单核细胞经PMA诱导分化为M0巨噬细胞后进行间接共培养和条件培养基刺激实验，并使用NLRP3抑制剂MCC950干预。构建皮下异种移植模型，采用免疫组化、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测蛋白表达和分泌水平。人LUAD配对癌旁组织及血清样本来源于天津市胸科医院。
研究结果方面，3.1 衰老相关转录特征在LUAD中的展现及ANGPTL4作为候选介质的出现：通过比较肿瘤与正常组织中衰老相关基因的表达谱，层次聚类显示两组间表达模式不同，SPP1和MMP1等基因在肿瘤组织中表达较高；功能富集分析显示差异表达基因与白细胞迁移、细胞因子活性和趋化因子受体结合相关，KEGG分析进一步识别出IL-17信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等炎症通路，提示LUAD中衰老相关转录改变伴随炎症和微环境相关基因程序。进一步评估预后相关性，单因素Cox回归识别出PTBP1、VEGFC、HMGB1和IGFBP1等与总生存相关的基因，而ICAM3和IL2与较低估计风险相关；LASSO-Cox回归后通过多因素Cox回归构建了包含VEGFC、PTBP1、ANGPTL4、PTGES和ICAM3的五基因预后模型，其中前四者具有正系数而ICAM3具有负系数；TCGA队列中高风险评分患者总生存较差且死亡事件频率较高。在预后模型保留的基因中，ANGPTL4因编码分泌蛋白且可能在肿瘤细胞与微环境通讯中发挥作用而被选用于进一步研究。该模型在六个独立GEO队列中进一步评估，1年、3年和5年AUC范围为0.560至0.791，GSE31210中表现较弱；高风险组富集于细胞周期和增殖程序，包括G2M检查点、E2F靶点、MYC信号和剪接体相关通路；两风险组在免疫检查点表达、抗原呈递相关基因、预测药物反应谱、IPS和TIDE评分方面存在差异，低风险组IPS值较高而高风险组TIDE评分较高；免疫反卷积分析显示低风险组免疫细胞浸润总体较高，而高风险肿瘤ImmuneScore和StromalScore较低且估计肿瘤纯度较高；在补充TCGA-LUAD Cox分析中，风险评分与总生存相关，调整年龄、性别和分期后关联持续存在。
3.2 ANGPTL4蛋白水平在LUAD组织和患者血清中升高：免疫组化分析显示LUAD组织中ANGPTL4染色强于癌旁非肿瘤组织，Ki-67染色在肿瘤组织中也较高；配对肿瘤与癌旁样本的Western blot分析进一步支持LUAD组织中ANGPTL4蛋白丰度增加；血清ELISA显示LUAD患者循环ANGPTL4浓度高于对照个体，这些观察提供了所检查LUAD组织中ANGPTL4蛋白丰度增加及患者队列中循环ANGPTL4水平升高的证据。
3.3 单细胞分析揭示巨噬细胞和单核细胞群体中衰老相关基因集评分较高：研究人员分析了NSCLC单细胞数据集HRA002509，经质量控制和批次校正后，降维和聚类识别出十一个主要细胞群体，包括T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、上皮细胞、增殖细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞，细胞类型分配由CD3D/CD3E、MS4A1、LYZ/CD68、EPCAM和COL1A1/COL1A2等经典标志物支持。采用AUCell、UCell、singscore、AddModuleScore和GSVA五种互补评分方法估计衰老相关基因集评分，巨噬细胞和单核细胞评分总体高于B细胞和T细胞群体，UMAP和小提琴图分析进一步显示较高评分集中于巨噬细胞和单核细胞富集区域；在单细胞水平，NMPR病例来源细胞复合评分高于MPR和pCR病例，但这些汇总的细胞水平比较为描述性，不能确立患者水平治疗反应差异。CellChat分析提示高评分组推断的配体-受体通讯强于低评分组，尤其在巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和上皮细胞之间。联合inferCNV分析识别出相对于T细胞参考具有升高且协调拷贝数变异信号的上皮亚群，基于这些模式将k-means聚类2–5中的上皮细胞分类为推定恶性细胞（21,850个细胞），其余31,208个上皮细胞视为推定非恶性；这些群体间衰老相关评分差异呈方法依赖性而非在恶性细胞中一致升高；恶性细胞显示较高的平均ANGPTL4表达，具有显著的细胞水平分布差异；在六名符合条件的术后患者中，恶性细胞ANGPTL4表达与巨噬细胞NLRP3、IL1B、CASP1或GSDMD无显著相关性。
3.4 ANGPTL4敲低和过表达改变LUAD细胞的增殖、迁移和SA-β-gal阳性率：在多种肺癌细胞系中评估ANGPTL4表达，A549和H1650细胞中观察到相对较高的表达，因此选择这两种细胞系进行后续实验；siRNA介导的敲低降低A549细胞中ANGPTL4 mRNA和蛋白表达，ANGPTL4敲低伴随伤口愈合和Transwell实验中迁移能力降低，ANGPTL4沉默后SA-β-gal阳性细胞比例也较低。相反，通过慢病毒转导生成稳定过表达ANGPTL4的A549细胞，RT-qPCR和Western blotting确认ANGPTL4表达增加；ANGPTL4过表达与细胞增殖增强相关，伤口愈合和Transwell实验中迁移增加，且过表达细胞显示更高的SA-β-gal阳性细胞比例。在H1650细胞中ANGPTL4敲低或过表达后也观察到迁移、增殖相关读数及SA-β-gal阳性率的类似变化。这些实验表明ANGPTL4操纵改变LUAD细胞迁移、增殖和SA-β-gal阳性率；由于这些实验中衰老主要通过SA-β-gal染色评估，结果被解释为衰老样或衰老相关表型改变而非完整经典衰老程序的证据。
3.5 ANGPTL4过表达增加LUAD异种移植生长：将稳定过表达ANGPTL4的A549细胞或相应对照载体细胞皮下注射入裸鼠，来源于过表达ANGPTL4细胞的肿瘤显示更大的肿瘤体积和更高的最终肿瘤重量；Western blotting和免疫组化确认异种移植组织中ANGPTL4表达增加；Ki-67染色显示过表达ANGPTL4细胞来源肿瘤中增殖活性较高，这些发现支持在该模型中ANGPTL4表达升高与LUAD异种移植生长增加之间的关联。
3.6 过表达ANGPTL4的LUAD细胞诱导与NLRP3信号相关的巨噬细胞炎症改变：ELISA确认过表达ANGPTL4的A549细胞条件培养基中ANGPTL4浓度较对照细胞增加；过表达ANGPTL4细胞的条件培养基在未稀释和1:1稀释时均增加未转染A549细胞在Transwell实验中的迁移，该处理伴随E-cadherin降低及Vimentin、Slug和Twist表达增加，与上皮-间质转化（EMT）相关表达模式一致；包含na?ve A549细胞和过表达ANGPTL4 A549细胞的间接共培养系统产生类似的迁移能力增加。随后检查肿瘤细胞分泌组对THP-1来源巨噬细胞的影响，暴露于过表达ANGPTL4细胞条件培养基或与其间接共培养的巨噬细胞显示M2相关标志物CD206表达降低，炎症相关标志物CD86、IL-1β和TNF-α mRNA水平升高；暴露于过表达ANGPTL4肿瘤细胞分泌组的巨噬细胞中NLRP3、GSDMD和Caspase-1等NLRP3相关基因以及CCL2和PD-L1表达也增加；Western blotting确认暴露于过表达ANGPTL4细胞条件培养基的巨噬细胞中NLRP3、GSDMD和IL-1β蛋白水平较高；ELISA一致地显示共培养系统收集的条件培养基中IL-1β分泌增加。为评估NLRP3相关信号是否参与这些巨噬细胞反应，用NLRP3抑制剂MCC950预处理巨噬细胞，MCC950部分降低与暴露于过表达ANGPTL4细胞条件培养基相关的NLRP3、GSDMD、IL-1β和CD86增加。这些数据将过表达ANGPTL4的LUAD细胞分泌组与巨噬细胞炎症重塑相关联，而ANGPTL4的具体贡献仍未解决。
讨论部分总结：本研究通过衰老相关转录组分析将ANGPTL4优先选出，并检查其与LUAD细胞表型及巨噬细胞对肿瘤细胞分泌组反应的关系。整合批量转录组分析、单细胞RNA测序、临床样本分析和功能实验，研究发现LUAD中衰老相关转录改变与炎症和免疫相关特征相关；单细胞分析进一步将较高衰老相关基因集评分定位到巨噬细胞和单核细胞富集区室，并揭示高评分组中细胞间通讯增加；此外，ANGPTL4在LUAD组织中上调并促进肿瘤细胞增殖、迁移、SA-β-gal阳性率改变和异种移植生长；过表达ANGPTL4细胞的条件培养基还诱导巨噬细胞炎症改变，这些改变被MCC950减弱。单细胞发现需谨慎解释，SenMayo包含可被髓系细胞组成性表达的炎症和分泌基因，高评分可能反映细胞身份或激活而非衰老；数据集包含LUAD和鳞癌并包括治疗相关变异；上皮比较未确立恶性细胞是所有细胞类型中ANGPTL4的主要来源，也未确立恶性细胞内ANGPTL4与高、低衰老评分之间的关联；六患者巨噬细胞相关性分析样本量小且无显著关联。细胞衰老传统上被视为肿瘤抑制反应，但衰老具有异质性，其效应取决于细胞背景、持续时间和分泌组成；衰老细胞可通过释放细胞因子、趋化因子、生长因子和基质重塑分子影响邻近上皮、基质和免疫细胞；治疗诱导的衰老也可能促进癌症干性和肿瘤复发，尽管本研究未检查这些过程。本研究中ANGPTL4操纵改变SA-β-gal阳性率同时影响增殖和迁移，因此这些发现应解释为衰老相关或衰老样特征的证据而非完整经典衰老程序；由于这些终点在单独实验中评估，单个SA-β-gal阳性细胞的增殖状态仍未知，溶酶体活性增加、细胞密度差异或异质性细胞状态可能促成染色结果但未直接检验；缺乏稳定生长停滞证据和额外独立标志物，这些发现未确立明确的衰老细胞群体。近期研究显示衰老滑膜成纤维细胞通过旁分泌ANGPTL4信号促进炎症巨噬细胞反应，支持ANGPTL4在衰老相关细胞间通讯中的可能作用；与这一可能性一致，过表达ANGPTL4的LUAD细胞条件培养基增加邻近肿瘤细胞迁移并伴随EMT相关表达模式；慢性炎症信号可强化SASP相关重塑并创建肿瘤许可微环境，因此过表达ANGPTL4细胞的条件培养基影响受体肿瘤细胞迁移和巨噬细胞炎症标志物。NLRP3是调节caspase-1激活及IL-1β和IL-18等炎症细胞因子成熟的先天免疫传感器，NLRP3信号失调已被牵涉于慢性炎症和癌症进展，炎症小体相关通路也与细胞应激和衰老相关反应相关；本实验中过表达ANGPTL4的LUAD细胞分泌组增加THP-1来源巨噬细胞中炎症标志物和NLRP3相关蛋白，这些改变被MCC950减弱，支持NLRP3信号对巨噬细胞反应的贡献；然而研究未证明ANGPTL4直接激活NLRP3，负责该反应的确切分子组分仍有待确定。
研究结论部分翻译：总之，ANGPTL4过表达增加LUAD细胞增殖、迁移和异种移植生长并改变SA-β-gal阳性率。过表达ANGPTL4细胞的条件培养基诱导巨噬细胞炎症改变，其中一些被MCC950减弱。然而，若干局限性制约了这些发现。衰老相关基因集评分和SA-β-gal染色未确立稳定生长停滞或明确衰老状态。还需要在具有低内源性ANGPTL4表达的其他LUAD模型中进行验证。条件培养基实验未将细胞外ANGPTL4的贡献与其他分泌因子区分开。巨噬细胞反应仅在THP-1来源细胞中评估，未在原发性外周血单核细胞或来自独立供体的单核细胞来源巨噬细胞中验证。也未检查免疫细胞条件培养基对LUAD细胞的相互影响。最后，异种移植实验未确定巨噬细胞或NLRP3信号是否介导观察到的肿瘤生长。
