整合单细胞与批量转录组分析揭示肝细胞癌核糖体生物发生相关分子亚型及免疫特征

《Biology》：Integrative Single-Cell and Bulk Transcriptomic Analysis Reveals Ribosome Biogenesis-Associated Molecular Subtypes and Immune Characteristics in Hepatocellular Carcinoma

肝细胞癌（HCC）表现出显著的分子异质性。研究人员整合单细胞与批量转录组数据，探究核糖体生物发生相关（RiboSis相关）基因表达与HCC分子及免疫特征的关联。在肝细胞亚群中，GLUL⁺肝细胞的RiboSis相关基因集评分最高，配体–受体分析推断ALDOA⁺与GLUL⁺肝细胞之间存在MDK–SDC2相互作用。特征筛选鉴定出4个候选基因，随后的亚型分析突出了BOP1和EXOSC4。两个分子亚型在RiboSis相关基因表达、免疫细胞特征评分、突变谱、检查点基因表达及TIDE评分方面存在差异。免疫组织化学显示HCC中BOP1和EXOSC4染色高于配对癌旁组织。在组织芯片中，HBV相关HCC的EXOSC4染色低于非病毒性HCC。这些发现将RiboSis相关表达与HCC中不同的分子及推断的免疫特征相关联。这些亚型对免疫治疗的临床相关性以及BOP1和EXOSC4的功能作用尚需进一步验证。

肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的80%以上，是全球重大健康负担。据GLOBOCAN 2024统计，肝癌为全球第七大常见诊断癌症和第三大癌症相关死亡原因，2024年新增约843,000例、死亡732,000例。在中国原发性肝癌患者中，乙型肝炎病毒（HBV）占75.09%（呈上升趋势），HBV–丙型肝炎病毒（HCV）合并感染占4.98%。早期HCC一线治疗包括经皮消融、肿瘤切除和肝移植，但多数病例确诊时已处于中晚期，5年生存率低于10%。免疫治疗作为系统性选择（包括新辅助治疗）具有前景，但其疗效与安全性仍在评估中。值得注意的是，HCC对免疫治疗敏感性低，PD-1检查点抑制剂单药治疗的客观缓解率仅约20%，这主要归因于其发病、进展和耐药机制的复杂性。因此，深入理解肿瘤内在生物学程序及其与免疫微环境的关系，可能有助于识别与HCC异质性及潜在治疗反应相关的分子特征。

核糖体生物发生（RiboSis）是一个由RNA聚合酶、核糖体蛋白（RPs）和反式作用因子协同参与的精密协调过程，用于产生执行蛋白质合成的核糖体；其过度激活促进细胞失控增殖。既往研究表明，HBV和HCV蛋白可通过不同分子机制增强rRNA转录从而促进核糖体生物发生。新近证据显示，过度的核糖体合成不仅驱动肿瘤发生，还作为癌症恶性和预后标志。除在核糖体组装和翻译中的经典作用外，多种核糖体蛋白还具有参与细胞周期调控、应激反应和免疫信号传导的核糖体外功能。核糖体异质性也可能影响特定转录本子集的翻译，从而改变肿瘤相关表型。例如，核糖体P-stalk组成的改变已被证实与HLA I类表达改变及CD8⁺ T细胞介导的肿瘤识别相关，提示核糖体调控与抗肿瘤免疫之间存在潜在联系。尽管越来越多的证据将核糖体生物发生失调与癌症进展相联系，但RiboSis活性在HCC中的细胞分布及其与分子异质性和免疫微环境的关系仍未被完全阐明。特别是，哪些HCC细胞群体表现出升高的RiboSis活性、RiboSis相关转录程序如何与细胞间通讯和免疫浸润相关联，以及这些特征能否用于定义生物学上不同的HCC亚型，目前尚不清楚。

为解决这些问题，研究人员整合单细胞与批量转录组分析，以表征RiboSis相关细胞状态并鉴定HCC中的候选RiboSis相关基因。研究人员进一步研究了RiboSis相关分子亚型在通路活性、推断的免疫细胞浸润、体细胞突变模式、预测的药物和免疫治疗反应以及组织水平蛋白表达方面的特征。这些分析旨在表征RiboSis与HCC异质性之间的关联，并为后续实验和临床验证产生假设。

在方法学上，研究人员运用了以下关键技术：单细胞RNA测序数据分析（GSE149614，含10例原发HCC和8例癌旁非肿瘤样本）采用Seurat流程进行聚类与注释，并以AUCell量化RiboSis基因集活性；批量转录组数据来自TCGA-LIHC（374例肿瘤、50例非肿瘤）和GSE76427（115例肿瘤、52例癌旁），合并为训练队列（489例肿瘤、102例非肿瘤），以ComBat校正批次效应；采用Monocle 2进行拟时序轨迹重建，CellChat推断细胞间通讯，pySCENIC进行单细胞调控网络推断；通过LASSO回归、随机森林和SVM-RFE三种机器学习方法交集筛选特征基因；以ConsensusClusterPlus进行共识聚类定义分子亚型；并运用GSEA、GSVA、ssGSEA（基于TISIDB的28种免疫细胞特征）、oncoPredict药物敏感性预测、TIDE免疫治疗反应预测、maftools突变图谱分析以及组织芯片（TMA，48例HCC及配对癌旁组织）免疫组织化学验证BOP1和EXOSC4蛋白表达。

结果方面：单细胞聚类、注释及RiboSis相关细胞鉴定——从18个样本获得59,578个细胞，聚类为12个簇并注释为T/NK细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞、髓系细胞和成纤维细胞六类；肝细胞在HCC发生时RiboSis活性显著升高且高于其他细胞类型。肝细胞再聚类鉴定出CXCR4⁺、FXYD2⁺、GLUL⁺、STMN1⁺、MT1G⁺、ALDOA⁺和CTTN⁺七个亚群，其中GLUL⁺肝细胞的RiboSis基因集AUCell评分最高且在HCC组特异性富集。拟时序分析——轨迹显示肝细胞在一个主要分支点分化为三种状态，HCC样本主要分布于State 1和State 3；CTTN⁺肝细胞集中于State 2，GLUL⁺肝细胞主要位于State 1；三个谱系分别富集于类固醇和脂肪酸代谢、白细胞黏附与淋巴细胞活化、类固醇激素反应与生殖系统发育。细胞通讯分析——ALDOA⁺肝细胞主要作为信号发送者，GLUL⁺肝细胞为主要信号接收者；关键通路包括MK、MIF、SPP1、ANGPTL和VISFATIN；最显著的相互作用为ALDOA⁺与GLUL⁺肝细胞间由MDK–SDC2轴介导。单细胞调控网络分析与药物预测——LEF1和TFAP2C在GLUL⁺肝细胞中高度特异表达，但DGIdb数据库未发现针对这两个转录因子的已知可靶向化合物。HCC中RiboSis相关基因的筛选与富集——GLUL⁺肝细胞与其他亚群比较获得786个差异表达基因，HCC与正常对照比较获得2124个差异表达基因，与331个参考RiboSis相关基因取交集得到12个重叠基因（RPS14、RPL27、BOP1、NHP2、EXOSC4、RPL35A、RPL7A、AATF、EIF4A3、RPS16、RPS6、RPSA）；GO和KEGG富集分析显示这些基因主要与核糖体生物发生、核糖核蛋白复合物生物发生、rRNA加工及核糖体通路相关。机器学习算法筛选枢纽基因——LASSO回归鉴定10个候选基因，随机森林基于MDA和MDG保留前9个基因，SVM-RFE筛选5个关键基因，三者交集最终确定BOP1、EXOSC4、NHP2和RPL27四个共识基因。基于枢纽基因的HCC患者分层与通路功能分析——以k=2为最优聚类数将样本分为Subtype 1和Subtype 2，TCGA-LIHC中167例归为Subtype 1、171例归为Subtype 2；亚型间差异表达分析与机器学习筛选基因取交集鉴定出BOP1和EXOSC4两个枢纽基因，二者在Subtype 2中显著上调，ROC分析证实其强判别能力（BOP1 AUC为0.8794，EXOSC4 AUC为0.8563）；GSEA显示Subtype 2显著富集于亚油酸代谢、自身免疫性甲状腺疾病和同种异体移植排斥，Subtype 1富集于卵母细胞减数分裂、青年发病型糖尿病和错配修复。免疫浸润分析——基于28种免疫细胞特征的ssGSEA显示多数免疫细胞间呈显著正相关；除活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞、CD56^bright NK细胞、γδ T细胞和Th17细胞外，多数亚群（包括活化CD8⁺ T细胞、活化树突状细胞（DCs）和髓源性抑制细胞（MDSCs））在RiboSis相关亚型间存在显著差异；BOP1表达与活化CD8⁺ T细胞、活化DCs和肥大细胞正相关，与NK细胞负相关；EXOSC4与活化CD8⁺ T细胞、活化DCs、肥大细胞和MDSCs正相关，与NK细胞负相关。亚型间药物敏感性与TMB分析——TMB分析显示TP53为最常见突变基因，Subtype 2突变率显著高于Subtype 1；Subtype 1对Daporinad、BI-2536和Sepantronium bromide更敏感，Subtype 2对AZD7762、AZD8055、BMS-754807、Rapamycin和Vinorelbine更敏感。免疫检查点分析——TIDE分析显示Subtype 1总体TIDE和Exclusion评分较高但Dysfunction评分较低；TIDE模型判定Subtype 2中更大比例样本为潜在应答者；TNFRSF4、SIGLEC10和HAVCR2等免疫检查点基因表达在亚型间存在差异。泛癌总生存与枢纽基因的关系——单因素Cox回归分析显示EXOSC4高表达与10种癌症的总生存显著相关（在ACC、UVM和LAML中为风险因素，在LUSC和LGG中为保护因素）；BOP1表达与19种癌症总生存显著相关（在LIHC、ACC、CESC和HMSC中为风险因素，在CHOL、LGG和BRCA中为保护因素）。免疫组织化学分析——H-score分析表明BOP1和EXOSC4在HCC组织中显著高表达于配对癌旁组织；EXOSC4的IHC H-score在HBV相关HCC患者中显著低于无肝炎病毒感染的HCC患者，而BOP1和EXOSC4表达与年龄、性别、肿瘤大小、AFP水平等其他临床参数无关联。

讨论部分总结：研究人员采用整合生物信息学方法鉴定了HCC中RiboSis相关基因，定义了RiboSis相关分子亚型并考察其与通路活性、免疫细胞浸润、体细胞突变模式、预测治疗反应及组织水平蛋白表达的关联。再聚类分析显示RiboSis活性在表达谷氨酰胺合成酶（GS）基因的GLUL⁺肝细胞中显著升高且为HCC组特异性；但研究所用RiboSis评分源自转录组基因集活性，并不直接测量核糖体生成或翻译输出，拟时序轨迹和推断的MDK–SDC2相互作用亦为计算推断关系而非谱系转换或功能性细胞间信号传导的直接证据。12个候选基因中7个为核糖体蛋白基因，但其对HCC进展和免疫重塑的个体功能贡献未在本研究中探讨。BOP1为参与核糖体生物发生和rRNA加工的核仁蛋白，既往研究提示其通过促进上皮–间质转化和细胞骨架重塑参与HCC侵袭和迁移，并与不良临床特征和预后相关；EXOSC4为RNA外泌体复合物核心结构亚基之一，通过维持致癌RNA稳定性驱动肿瘤进展，已成为新兴预后标志和潜在治疗靶点。通路富集结果应解释为注释于这些通路的基因表达差异，而非相应疾病过程本身在HCC中发生；亚油酸代谢改变可能与HCC生物学相关，免疫相关基因集富集可能反映两亚型间免疫活化、炎症信号或抗原加工通路的差异。免疫浸润分析显示BOP1和EXOSC4表达与推断的活化CD8⁺ T细胞、活化DCs和肥大细胞浸润正相关、与NK细胞浸润负相关，但本研究未直接测量肿瘤细胞MHC-I丰度、KIR/NKG2A信号或免疫细胞功能，故不能确立BOP1、EXOSC4或RiboSis活性通过MHC-I依赖机制直接调控CD8⁺ T细胞或NK细胞浸润。Subtype 2肿瘤突变负荷较高，但此关联不能确立本HCC队列的治疗获益；TIDE分析显示Subtype 2总体TIDE和Exclusion评分较低但Dysfunction评分较高，提示计算推断的免疫逃逸特征存在差异；由于未分析免疫治疗队列或观察到的应答终点，两亚型在免疫检查点抑制剂临床获益上是否存在差异仍未知。EXOSC4在HBV相关HCC中表达低于非病毒性HCC，但差异基础尚不清楚，研究未确立EXOSC4表达与HBV复制、持续感染或HBV相关肝癌发生的因果联系。局限性包括：主要依赖回顾性公共数据集，需前瞻性多中心队列验证所提出的RiboSis相关分类的临床适用性；机器学习特征筛选虽采用交叉验证但未进行独立外部验证；未在两个分子亚型间进行Kaplan–Meier生存分析，分类的预后分层价值尚待确立；未对BOP1和EXOSC4进行纳入临床协变量的多因素Cox回归，其独立预后价值尚待确立；TCGA-LIHC患者临床记录中AFP水平和肝病病因不可用；TMA队列缺乏生存随访数据；TMA样本量相对较小（48例HCC及配对癌旁组织）可能限制结果的普适性；缺乏功能实验无法确立其在HCC进展或免疫调控中的因果作用；基于TIDE、TMB和免疫浸润的计算预测不能替代实际临床免疫治疗结局，缺乏接受免疫检查点抑制剂治疗的独立HCC患者队列限制了临床相关性验证。

结论部分翻译：该研究将RiboSis相关表达与不同的HCC细胞状态、分子亚型和推断的免疫特征相关联。BOP1和EXOSC4显示出更高的肿瘤染色，且在所分析的组织芯片中EXOSC4随HBV状态而变化。尚需独立队列验证、功能实验和免疫治疗结局数据以确立临床效用或机制。