《Biology》：Comparative Transcriptome Analysis Identifies Candidate Coordinated Defense Mechanisms in Corn Stalk Rot Resistance
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玉米茎腐病（CSR）是一种毁灭性的土传病害，但组成型抗性的转录基础尚不清楚。本研究对病原菌挑战条件下的抗CSR玉米品种齐319（JR）和感CSR玉米品种掖478（JS）进行了比较转录组分析。共鉴定出6009个差异表达基因（DEGs）（JR中3074个上调，29
玉米茎腐病（CSR）是一种毁灭性的土传病害，但组成型抗性的转录基础尚不清楚。本研究对病原菌挑战条件下的抗CSR玉米品种齐319（JR）和感CSR玉米品种掖478（JS）进行了比较转录组分析。共鉴定出6009个差异表达基因（DEGs）（JR中3074个上调，2935个下调），JR表现出更高比例的低表达基因。基于所有DEGs的功能富集鉴定出黄酮类生物合成、角质/蜡质生物合成、α-亚麻酸代谢（茉莉酸合成）以及淀粉/蔗糖代谢途径的显著过表征。加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出候选枢纽基因，包括Zm00001d006069、Zm00001d043607（hexokinase6）和Zm00001d044122（anthocyaninless1），可能与调控作用相关。qRT-PCR验证了关键基因的差异表达。亚细胞定位实验进一步表明，Zm00001d044122（anthocyaninless1）和Zm00001d006069分别主要定位于细胞核和质膜。总之，本研究提供了与CSR抗性相关的转录组图谱，并提示了候选的协同物理、化学、激素和代谢防御途径。所鉴定的枢纽基因是标记辅助选择和遗传改良的候选靶标。然而，途径层面的解释是基于转录组的假设，需要代谢物谱分析和功能验证。
研究背景：玉米茎腐病（Corn Stalk Rot，CSR）主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）和层生镰刀菌（F. proliferatum）等病原真菌引起，是一种毁灭性土传病害，严重威胁全球玉米产量和籽粒品质。该病害以茎秆组织降解为特征，破坏营养运输并常导致植株早衰死亡。随着集约化种植制度下该病害发生频率不断增加，培育和种植抗性玉米品种已成为可持续病害管理的关键策略。然而，玉米对CSR抗性的分子机制，尤其是区分抗性与感性基因型在病原菌挑战下的转录重编程，仍认识不足。过去二十年中，数量性状位点（QTL）定位和全基因组关联研究（GWAS）已揭示多个与镰刀菌抗性相关的基因组区域，如qRfg1、qRfg2等，凸显了该性状的多基因性质。在已功能鉴定的基因中，参与细胞壁强化的基因（如Zm00001d037343（B6TL27）和Zm00001d025833（IDP1639），参与角质、软木脂和蜡质生物合成）已被证明有助于形成抵御病原菌入侵的物理屏障。此外，黄酮类生物合成途径中的基因（包括Zm00001d039833和Zm00001d043174）在产生具有直接抗真菌活性的植物抗毒素中发挥关键作用。调控茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）生物合成的α-亚麻酸代谢途径也已成为诱导系统抗性的关键调控因子，其中Zm00001d041204（lipoxygenase12）等基因可能是防御信号网络中的枢纽。此外，淀粉和蔗糖代谢相关基因（包括Zm00001d043607（hexokinase6））被认为可调节能量可用性和糖信号传导，从而影响防御相关基因的表达。尽管取得了这些进展，但大多数研究集中在单个途径或单个基因上，在统一田间条件下对抗性基因型和感性基因型进行全面的全转录组比较仍然有限，区分抗性与感性品系的协同表达模式仍未完全阐明。
研究内容与结论：本研究对两种对CSR具有 contrasting 抗性的玉米品种——抗CSR玉米品种齐319（JR）和感CSR玉米品种掖478（JS）——进行了比较转录组分析。在相同田间条件下收集两种基因型的叶片样品并进行高通量RNA测序。分析鉴定出JR与JS之间存在明显的表达谱差异，共鉴定出6009个差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），包括与黄酮类生物合成、角质和蜡质代谢以及α-亚麻酸代谢相关的基因。值得注意的是，途径富集和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）鉴定出几个可能与防御反应协调相关的候选枢纽基因。研究表明，JR维持更严格的基线转录水平（更高比例的低表达基因），但在病原菌挑战下协调激活多个防御过程，包括黄酮类植物抗毒素产生、角质/蜡质物理屏障强化、茉莉酸防御激素激活以及糖代谢重编程以供应能量。所鉴定的枢纽基因是标记辅助选择和遗传改良的候选靶标。该研究的重要意义在于提供了与CSR抗性相关的转录组图谱，提出了候选的协同物理、化学、激素和代谢防御途径，为解析多基因抗性机制和分子育种提供了理论基础和候选资源。
关键技术方法：研究人员以抗CSR玉米品种齐319（JR）和感CSR玉米品种掖478（JS）为实验材料，在温室条件下培养至4-5叶期，随机采集两个充分展开的叶片，每个品种三个生物学重复。采用TRlzol试剂提取叶片总RNA，经Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性和浓度后，利用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module分离mRNA，按照NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit说明书构建cDNA文库，在Illumina HiSeq?测序平台进行高通量转录组测序。测序数据经质控后采用TopHat2软件（version 2.1.1）比对到B73玉米参考基因组（v5.0），Cufflinks软件（version 2.2.1）以FPKM值估算基因表达水平，DESeq（version 1.48.0）进行差异表达分析（|log2 ratio| ≥ 2且p < 0.05）。通过BLASTX比对NCBI非冗余蛋白（Nr）数据库和Swiss-Prot数据库（E-value cutoff 10
?5）进行功能注释，Blast2GO进行GO注释，TopGO（R package，version 2.60.0）进行富集分析，KEGG途径注释通过Perl脚本完成。采用R包WGCNA（version 1.73）基于所有DEGs的表达矩阵进行加权基因共表达网络分析（保留至少在三个样本中FPKM > 1的基因）。选取8个枢纽基因采用qRT-PCR验证，以β-tubulin为稳定参考基因，采用2
?ΔΔCt方法计算相对表达量，采用双尾非配对Wilcoxon秩和检验评估统计差异（p < 0.05）。将Zm00001d044122（anthocyaninless1）和Zm00001d006069的编码区分别克隆到pBWA(V)H2STMVQ载体构建eGFP融合表达载体，以35S:eGFP空载体为对照，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101（psoup-p19）介导瞬时表达于本氏烟草（N. benthamiana）叶片，利用Nikon C2-ER共聚焦激光扫描显微镜观察亚细胞定位。
研究结果：
3.1 CSR抗性/感性玉米样品的转录组基础数据：通过对JR和JS叶片样品进行read比对分析，结果显示所有6个样品对玉米参考基因组的比对率均超过87%，JR样品总比对率为88.16%–89.02%，JS样品为87.28%–88.94%。唯一比对read在所有样品中占较高比例（JR为80.60%–82.14%，JS为79.04%–83.20%）。值得注意的是，JR样品中剪接read比例（32.33%–33.36%）略高于JS样品（26.10%–29.73%），而JS样品中非剪接read比例略高。共33162个基因检测到表达。根据FPKM值分组统计，JR组中低表达基因（FPKM < 1）比例为45.72%–50.08%，高于JS组（41.77%–45.90%）；反之，在中高表达区间（FPKM > 10），JS组基因比例（21.08%–25.86%）高于JR组（19.73%–23.69%）。在10 < FPKM < 30区间，JS1和JS3基因比例分别为15.45%和14.32%，明显高于JR样品（10.58%–12.03%）。在高表达区间（FPKM > 50），JS样品基因比例（5.10%–5.57%）也高于JR样品（4.14%–4.99%）。这些结果表明感性品种具有更多中高水平表达的基因，而抗性品种积累更多低表达基因，可能反映了两组间基础转录活性或胁迫响应基因表达调控的差异。
3.2 CSR抗性/感性玉米样品间基因总体表达差异：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）评估JR与JS样品间基因总体表达差异，结果显示JR样品与JS样品显著分离，第一主成分解释总变异的59.47%，第二主成分解释20.47%，累计79.94%，表明JR与JS样品间总体基因表达模式差异显著。基于FPKM水平表达数据，以p < 0.05且|log2(foldchange)| > 1为标准筛选DEGs，共发现6009个DEGs，包括3074个上调DEGs和2935个下调DEGs。火山图显示，前10个上调DEGs为Zm00001d008397、Zm00001d034421、Zm00001d035444、Zm00001d036773、Zm00001d015497（aco6）、Zm00001d018611（tps31）、Zm00001d046172、Zm00001d020209、Zm00001d040489（thx57）和Zm00001d034460（igl1）；前10个下调DEGs为Zm00001d039833、Zm00001d035570、Zm00001d032598（IDP174）、Zm00001d016679、Zm00001d017935、Zm00001d018893、Zm00001d012100、Zm00001d043649、Zm00001d029756和Zm00001d012032。
3.3 CSR抗性/感性玉米样品间KEGG功能途径差异：KEGG注释显示，次生代谢物生物合成、代谢途径、角质/软木脂/蜡质生物合成、黄酮类生物合成、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢以及芪类/二芳基庚烷类/姜辣素生物合成途径显著富集（FDR < 0.05）。其中174个和271个DEGs分别涉及次生代谢物生物合成和代谢途径，由于这两个途径覆盖面广、缺乏特异性，后续分析不再重点关注。黄酮类生物合成、角质/软木脂/蜡质生物合成、淀粉和蔗糖代谢及α-亚麻酸代谢途径分别富集10、8、27和12个DEGs。黄酮类化合物是玉米中重要的植物抗毒素，具有直接抗菌活性并参与木质素合成以强化细胞壁，是抗病反应中最重要的次生代谢途径之一。角质/软木脂/蜡质生物合成直接贡献于玉米表面物理屏障的形成。淀粉和蔗糖代谢调节可溶性糖的动态分布，为抗病提供能量并通过糖信号诱导防御基因表达。α-亚麻酸代谢是茉莉酸（JA）的直接合成途径，JA作为核心防御激素调控玉米对茎腐病、叶斑病及害虫取食的系统抗性。这四个途径分别对应抗病中的屏障强化、抗菌物质合成、能量代谢重编程和激素信号激活。表达热图显示，Zm00001d003584（12-oxo-phytodienoic acid reductase5）、Zm00001d044906（12-oxo-phytodienoic acid reductase2）和Zm00001d041204（lipoxygenase12）在所有抗CSR玉米样品中一致上调。在角质/软木脂/蜡质生物合成途径中，Zm00001d037343（B6TL27）和Zm00001d025833（IDP1639）表现出相似的表达模式。在黄酮类生物合成途径中，病原菌也增强了Zm00001d039833和Zm00001d043174（umc2381）的表达。淀粉和蔗糖代谢中共有10个DEGs（如Zm00001d021119（glu14）、Zm00001d038271和Zm00001d047253（sus1））上调。
3.4 基于DEGs表达水平的WGCNA分析：为鉴定与CSR相关的共表达基因模块并探索网络层面的调控机制，研究人员对转录组数据集进行了WGCNA分析。利用Cytoscape（v3.9.1）构建了turquoise模块内的基因共表达网络，网络可视化展示了前25个枢纽基因的相互作用景观，节点代表基因，边代表加权相关性。值得注意的是，Zm00001d006069（α-亚麻酸代谢，log2FC = 3.39，p = 0.002）、Zm00001d043607（hexokinase6，淀粉和蔗糖代谢，log2FC = ?1.90，p = 7.35 × 10
?7）和Zm00001d044122（anthocyaninless1，黄酮类生物合成，log2FC = 5.95，p = 8.20 × 10
?14）成为度数中心性最高的节点，提示它们可能是与调控作用相关的候选枢纽基因。
3.5 抗CSR玉米中枢纽基因的qRT-PCR验证：为验证转录组数据的准确性，选取了8个与α-亚麻酸代谢（Zm00001d006069）、黄酮类生物合成（Zm00001d044122（anthocyaninless1）、Zm00001d001960（fht1）和Zm00001d014914（a2））以及角质/软木脂/蜡质生物合成（Zm00001d019850、Zm00001d027837（ms26）、Zm00001d014055（cl3929_1）和Zm00001d051932）途径相关的DEGs进行qRT-PCR。结果显示，Zm00001d006069、Zm00001d044122（anthocyaninless1）、Zm00001d001960（fht1）、Zm00001d019850、Zm00001d027837（ms26）和Zm00001d051932在JR中的表达水平显著提高，与转录组数据一致。同时，与黄酮类生物合成相关的Zm00001d014914（a2）未显示统计学显著的表达差异，与转录组整体表达趋势一致。Zm00001d014055（cl3929_1）的表达水平在转录组和qRT-PCR结果之间不一致，提示Zm00001d014055（cl3929_1）可能与玉米CSR抗性无关。
3.6 Zm00001d044122和Zm00001d006069的亚细胞定位：为进一步研究枢纽基因的潜在功能，研究人员检测了Zm00001d044122（anthocyaninless1）和Zm00001d006069在本氏烟草表皮细胞中的亚细胞定位。35S:eGFP空载体在细胞质和细胞外周产生荧光。Zm00001d044122-eGFP融合蛋白的强GFP信号主要检测于细胞核，细胞质中信号较弱，表明Zm00001d044122主要定位于细胞核。相反，Zm00001d006069-eGFP融合蛋白的荧光主要位于细胞外周，与质膜定位一致。叶绿素自发荧光与GFP信号清晰分离，排除了叶绿体定位。这些结果表明Zm00001d044122和Zm00001d006069可能在不同亚细胞区室中发挥作用，可能分别涉及核转录调控和膜相关防御信号传导。
讨论部分总结：本研究通过抗CSR品种齐319（JR）与感CSR品种掖478（JS）的比较转录组分析，揭示了组成型抗性背后的广泛转录重编程。共鉴定出6009个DEGs（JR中3074个上调、2935个下调），表明近乎平衡但高度协调的转录转变。抗性品种表现出更高比例的低表达基因（FPKM < 1），而感性品种在中高表达范围（FPKM > 10和> 50）具有更多基因，提示JR维持更严格的基线转录调控。这种模式可能反映了避免防御相关基因组成型表达（常带来生长和适合度代价）同时保留病原菌攻击时快速诱导能力的适应性策略。相反，JS中整体升高的基线可能导致代谢低效或对感染响应性降低。PCA沿第一主成分（59.47%变异）强烈分离JR与JS，证实抗性相关转录架构高度独特。在JR中上调的top DEGs中，Zm00001d008397和Zm00001d034421代表值得进一步功能鉴定的新候选基因；Zm00001d008397编码与拟南芥耐盐相关蛋白（AT1G13930）同源的蛋白，可能参与ABA响应基因表达，但其在抗病中的作用此前未见报道；Zm00001d034421在公共数据库中缺乏已知功能注释，仅在真菌接种时观察到差异表达。它们在抗性基因型中的高表达及其未出现在主要富集防御途径中，提示它们可能代表CSR抗性网络中此前未被认识的组分。Top下调基因包括Zm00001d039833（黄酮类途径）和Zm00001d035570，提示某些次生代谢基因在抗性品系中组成型抑制，可能是为了允许病原菌触发的诱导性。Zm00001d014055（cl3929_1）在RNA-seq和qRT-PCR之间的差异可能源于其极低表达（FPKM < 0.5）和较小倍数变化（约1.8），二者均对可靠检测构成挑战；技术因素（如逆转录引物、引物效率或生物学变异的差异）可能对低丰度转录本被放大，因此其在CSR抗性中的作用仍不确定，需要用更灵敏的方法（如ddPCR）或在茎秆组织中增加重复进行验证。功能富集分析表明DEGs显著过表征于四个关键途径：黄酮类生物合成、角质/软木脂/蜡质生物合成、α-亚麻酸代谢（茉莉酸合成）和淀粉和蔗糖代谢，分别对应植物免疫的四大支柱——抗菌植物抗毒素产生、物理屏障强化、激素信号传导和代谢重编程。在黄酮类生物合成途径中，Zm00001d039833和Zm00001d043174等基因在JR未挑战条件下下调，与priming模型一致，即植物抗毒素生物合成基因维持在低基线水平但准备好在病原菌感知时强烈诱导。相反，在角质/软木脂/蜡质生物合成途径中，Zm00001d037343（B6TL27）和Zm00001d025833（IDP1639）等基因的表达模式提示JR中组成型物理屏障沉积增强，这与先前报道的细胞壁强化和表皮蜡质积累对土壤传播镰刀菌抗性的关键作用一致。α-亚麻酸代谢途径直接为茉莉酸（JA）生物合成提供底物，在JR中一致上调，Zm00001d041204（lipoxygenase12）和Zm00001d006069表达升高；JA是诱导系统抗性的主调控因子，已被证明介导玉米对茎腐病的防御；这些基因在JR样品中的一致上调提示JA信号在抗性基因型中组成型增强，这一特征可能有助于快速防御激活。此外，淀粉和蔗糖代谢相关基因（包括Zm00001d043607（hexokinase6）和Zm00001d021119）在JR中上调，表明碳流和能量分配重编程以支持持续防御反应；糖不仅满足代谢需求，还作为信号分子调节防御基因表达。总体而言，这些途径层面的变化提示JR中的CSR抗性可能涉及多个候选防御层而非单一机制。WGCNA进一步鉴定了与CSR抗性调控架构可能相关的共表达模块和候选枢纽基因，其中Zm00001d006069（α-亚麻酸代谢）、Zm00001d043607（hexokinase6，淀粉和蔗糖代谢）和Zm00001d044122（anthocyaninless1，黄酮类生物合成）表现出最高的度数中心性，提示它们可能是跨不同功能途径协调下游靶标的候选枢纽基因。Zm00001d006069作为枢纽的鉴定特别有意义，因为它编码JA生物合成级联中的推定脂氧合酶或相关酶，与观察到的JA相关途径富集一致。类似地，Zm00001d044122（anthocyaninless1）可能参与抗真菌黄酮类化合物的产生，而Zm00001d043607（hexokinase6）可能调节糖信号和能量状态。这些枢纽基因是通过突变体分析或过表达研究进行进一步功能验证的高优先级靶标。8个所选DEGs的qRT-PCR验证确认了大多数基因的差异表达，包括Zm00001d006069、Zm00001d044122（anthocyaninless1）、Zm00001d001960（fht1）、Zm00001d019850、Zm00001d027837（ms26）和Zm00001d051932，与RNA-seq数据高度一致；仅Zm00001d014055（cl3929_1）产生不一致结果，提示它可能不直接参与CSR抗性，而Zm00001d014914（a2）虽未达统计学显著，但遵循与转录组数据相同的趋势；这些验证结果增强了转录组分析的可靠性并强调了个体候选基因实验验证的重要性。此外，亚细胞定位实验显示Zm00001d044122（anthocyaninless1）主要定位于核内，而Zm00001d006069主要定位于质膜；Zm00001d044122的核定位与其作为黄酮类生物合成转录调控因子的推定作用一致，而Zm00001d006069的膜定位提示它可能参与防御过程中的膜相关信号传导或脂质代谢；这些发现进一步支持了枢纽基因的功能分化及其在CSR抗性网络中的潜在协调。总之，本研究提供了玉米组成型CSR抗性的全局转录组景观，揭示了物理屏障、抗菌合成、JA信号传导和代谢重编程的协同调控；所鉴定的枢纽基因（包括Zm00001d006069、Zm00001d043607（hexokinase6）和Zm00001d044122（anthocyaninless1））代表了标记辅助选择和CSR抗性遗传改良的有前景靶标。虽然需要在茎秆组织中通过功能遗传学方法进一步验证，但研究发现显著推进了对多基因抗性机制的理解，并为可持续玉米病害管理提供了实用资源——具体而言，标记辅助选择的候选标记（如与Zm00001d006069和Zm00001d044122连锁的SNPs）、CRISPR-Cas9基因编辑的靶标（如枢纽基因的过表达或启动子编辑）以及用于高通量抗性表型鉴定的基于表达的诊断工具。
研究结论翻译：总之，本研究提供了在田间条件下组成型抗性和感性玉米品种之间的全面转录组比较。共鉴定出6009个差异表达基因，抗性基因型表现出独特的转录架构，其特征是较低的基础表达水平和候选的防御相关途径协同激活。功能富集和WGCNA提示CSR抗性与四个途径的候选协同调控相关：黄酮类生物合成；角质、软木脂和蜡质生物合成；α-亚麻酸代谢（茉莉酸合成）；以及淀粉和蔗糖代谢。枢纽基因如Zm00001d006069、Zm00001d043607（hexokinase6）和Zm00001d044122（anthocyaninless1）被鉴定为这些途径中的中心调控因子，代表了标记辅助选择或遗传工程的有前景靶标。亚细胞定位分析进一步表明Zm00001d044122（anthocyaninless1）和Zm00001d006069分别主要定位于细胞核和质膜，支持它们在CSR抗性网络中的不同作用。这些发现提供了候选途径/基因、基于转录组的多基因CSR抗性假设以及标记辅助选择和后续功能鉴定的候选靶标，支持开发具有改良茎腐病抗性的玉米品种。尽管分析仅限于幼苗叶片组织且枢纽基因的功能作用仍有待于在茎秆组织和更广泛的种质中验证，但这些发现为未来工作提供了基础。
