《Biologics: Targets and Therapy》：Identification of m6A-Associated mRNAs, lncRNAs, and m6A Regulators in Endometriosis
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背景 子宫内膜异位症（EMs）可导致显著疼痛和不孕，持续影响育龄期女性，但其分子机制仍未被充分阐明。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是哺乳动物mRNA中最普遍的转录后修饰，近年来越来越多的研究聚焦于阐明m6A与EMs之间的关系，以期为临床防治提供理论依据。方法 研
背景 子宫内膜异位症（EMs）可导致显著疼痛和不孕，持续影响育龄期女性，但其分子机制仍未被充分阐明。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是哺乳动物mRNA中最普遍的转录后修饰，近年来越来越多的研究聚焦于阐明m6A与EMs之间的关系，以期为临床防治提供理论依据。方法 研究人员采用人m6A-mRNA和lncRNA表观转录组芯片技术、功能与通路富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）及R软件包，开展探索性分析，以鉴定与EMs相关的差异甲基化mRNA和lncRNA以及重要的m6A调节因子。上述发现通过外部数据库以及RNA提取和定量实时PCR（qPCR）、免疫组织化学和免疫荧光技术进行验证。结果 具体而言，分析揭示了1631个高甲基化上调、219个低甲基化上调及6483个低甲基化下调的差异甲基化与表达基因（DMEGs）。此外，研究人员鉴定了8个候选枢纽基因——RHOA、KCNA2、BDNF、CACNA1C、FGFR1、IL18、KCNIP2和RPL17——并表征了其富集通路。进一步，研究人员在EMs中观察到6个显著高甲基化和14个显著低甲基化的lncRNA。筛选鉴定出两个关键m6A调节因子WTAP和RBM15，可能作为值得在EMs背景下进一步研究的候选分子。结论 该探索性筛选分析描绘了子宫内膜异位症组织中m6A调节因子及其相关mRNA和lncRNA的异常表达特征，所得初步分子谱仅反映相关性，而非因果或确定的功能关系。
子宫内膜异位症（EMs）是指子宫内膜样组织出现在子宫腔以外的部位，是影响育龄期女性最常见的疾病之一，以高复发风险和显著侵袭性为特征，是导致不孕和慢性盆腔痛的重要原因，给患者带来沉重的心理和生理负担。目前EMs的发病机制尚无定论，经典的"经血逆流种植"学说也无法解释所有临床现象。近年研究表明，激素失衡、免疫功能障碍、表观遗传改变和氧化应激等共同参与病灶的持续存在和治疗抵抗，但相关分子机制仍需深入探究。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是真核生物RNA中最常见且丰度最高的RNA修饰之一，发生于腺嘌呤第6位氮原子，是一种动态可逆的修饰，由m6A甲基转移酶、m6A去甲基化酶和m6A阅读蛋白共同调控，通过影响mRNA稳定性、转录、剪接、翻译和降解参与多种生物学过程和疾病调控。已有研究显示m6A修饰在EMs中显著下调，且主要富集于AAACU基序；FTO在EMs患者中下调，影响糖酵解、增殖及异位子宫内膜间质细胞转位；METTL3和METTL14在异位内膜中表达下调并促进子宫内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭；阅读蛋白IGF2BP2促进EMs发生；METTL3介导SIRT1的m6A修饰，YTHDF2识别并降解SIRT1 mRNA，从而抑制细胞衰老并促进子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭和异位种植；低氧通过HDAC11抑制YTHDF2转录，YTHDF2缺失阻止NFE2L1 mRNA降解，激活NF-κB/STAT3炎症通路促进EMs进展。这些发现提示m6A修饰酶通过调控相关基因的m6A修饰水平在EMs中发挥关键作用，鉴定关键m6A调节因子可能成为未来EMs治疗的潜在靶点。基于此，研究人员旨在刻画EMs相关的分子改变、功能修饰及m6A变异特征，利用人m6A-mRNA和lncRNA表观转录组芯片鉴定差异m6A甲基化mRNA和lncRNA，分析差异甲基化与表达基因（DMEGs）之间的潜在关系，并对差异表达和甲基化mRNA进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，最后在组织中验证筛选出的关键m6A调节因子的表达，以期为开发新的治疗策略提供线索。
研究人员开展的是探索性筛选分析。组织样本收集方面，2022年5月至8月在哈尔滨医科大学附属第一医院收集3例异位子宫内膜异位症样本（EI）和3例正常子宫内膜样本（NE），异位样本来自接受卵巢巧克力囊肿手术的患者，正常子宫内膜组织来自因子宫肌瘤行子宫切除术的患者作为对照，研究经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准，所有组织标本立即保存于液氮中，并经组织病理学评估确认诊断。主要关键技术方法包括：采用人m6A-mRNA和lncRNA表观转录组芯片（8×60K，Arraystar）进行甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）结合芯片杂交分析，以Cy5和Cy3分别标记修饰和未修饰RNA，计算m6A富集水平并以|FC|≥2、p<0.05为阈值判定差异甲基化；采用GO和KEGG进行功能与通路富集分析（以P<0.05、FDR<0.1为显著性标准）；利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）并以Cytoscape可视化；使用R软件包分析22个m6A调节因子的差异表达（Mann-Whitney U检验）及Spearman相关分析；利用GSE7305数据集进行外部验证；并采用RNA提取与定量实时PCR（qPCR，每组n=12）、免疫组织化学和石蜡切片免疫荧光对WTAP和RBM15进行验证。原始m6A mRNA数据已上传至NCBI数据库（登录号GSE248593）。
结果部分如下：
鉴定EMs的mRNA表达谱及其功能富集：通过分析芯片中Cy3和Cy5荧光染料强度，比较EI与NE的mRNA表达，层次聚类分析显示两组转录本表达模式存在差异；共鉴定出7186个差异表达mRNA转录本（|FC|≥1.5，p<0.05，每组n=3），其中EI相对NE有4320个mRNA下调和2866个上调；GO和KEGG分析探讨了上调与下调mRNA的潜在功能；总体差异表达分析显示EMs中存在广泛的基因表达抑制，可能参与疾病发病机制；高甲基化基因主要富集于"神经活性配体-受体相互作用"和"细胞黏附分子通路"，而低甲基化基因显著影响"神经退行性疾病-多种疾病"和"肌萎缩侧索硬化通路"；并对差异甲基化基因进行了GO的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）分析。
不同表达基因及其对应m6A甲基化水平的整合分析：为阐明m6A修饰与基因mRNA表达的关系，研究人员整合mRNA表达与m6A甲基化数据，鉴定出1631个高甲基化上调、219个低甲基化上调及6483个低甲基化下调的DMEGs，未发现满足高甲基化下调类别联合阈值的转录本；基于倍数变化列出前20位显著DMEGs；指出归一化前须先从原始芯片信号中减去背景值，低于背景阈值的探针被排除，对于仅略高于背景值的探针倍数变化估计可能不稳定，补充表中基因需独立实验验证；这些探索性发现提示RNA m6A甲基化可能在EMs中调控mRNA表达水平；利用STRING的PPI数据和Cytoscape Hubba插件分析前8个候选枢纽基因：RHOA、KCNA2、BDNF、CACNA1C、FGFR1、IL18、KCNIP2和RPL17；KEGG通路富集分析表明这些DMEGs主要参与"MAPK信号通路""代谢通路""癌症通路"和"Rap1信号通路"；在Turku子宫内膜异位症数据库中验证8个候选枢纽基因表达，热图显示RHOA、KCNA2和FGFR1在卵巢子宫内膜异位症中表达显著异常（p<0.05）。
m6A修饰lncRNA的显著改变：基于m6A表达改变及其相互作用网络，研究人员对EI和NE中免疫沉淀的m6A甲基化lncRNA（2884个lncRNA）进行谱型分析，以Cy5荧光染料标记评估m6A修饰；层次聚类用于样本分类并阐明lncRNA m6A甲基化水平模式；火山图分析显示，与NE相比，EI中6个lncRNA显著高甲基化、14个lncRNA显著低甲基化（|FC|≥5，p<0.01，每组n=3）。
m6A调节因子在EI中的表达改变：为探究m6A甲基化状态改变及其在EI中的潜在作用，研究人员通过芯片分析评估m6A调节因子的mRNA表达水平，VIRMA因信号强度低被排除；层次聚类热图和火山图显示，EI相对NE中RBM15、WTAP、ALKBH5和YTHDC2显著下调，FMR1显著上调（p<0.05）；差异表达分析鉴定出22个表达改变的m6A调节因子，其中RBM15倍数变化最大，WTAP在火山图中统计学改变最显著；对6个样本（EI对NE）中22个m6A调节因子表达水平进行Spearman相关分析，鉴定出四个不同簇，提示在EI中协同发挥作用，四簇分别为：（1）CBLL1、YTHDF1、FMR1、IGF2BP1和ZC3H13；（2）LRPPRC、METTL16、ALKBH5、METTL14、ELAVL1和RBM15；（3）WTAP、EIF3A和YTHDF3；（4）METTL3、YTHDC2、HNRNPA2B1、YTHDF2、IGF2BP2、IGF2BP3、FTO和YTHDC1；在GSE7305数据集中进一步验证WTAP、ALKBH5、RBM15、YTHDC2和FMR1五个m6A调节因子的表达水平，结果证实WTAP和RBM15的表达与芯片分析一致。
WTAP和RBM15在临床组织样本中的差异表达：采用qPCR、免疫组织化学染色和石蜡切片免疫荧光评估组织样本中WTAP和RBM15的表达，分析显示EI组中WTAP和RBM15表达水平均低于NE组（每组n=12）。
讨论部分总结：EMs以子宫内膜组织在子宫腔外生长为特征，在局部激素因素和炎症微环境支持下，异位病灶逐渐播散至卵巢、输卵管和腹膜等部位，导致周期性盆腔痛、痛经、排尿痛、排便痛和性交不适等症状，不仅危害生育力，还显著增加子宫内膜癌和卵巢癌风险。m6A修饰作为哺乳动物最普遍的转录后修饰，不仅调控mRNA，还调控lncRNA、microRNA和小核RNA，影响几乎整个转录组。本研究采用m6A-mRNA和lncRNA表观转录组芯片鉴定卵巢EMs相比正常子宫内膜的差异表达和差异甲基化m6A相关mRNA，分析异常表达基因的富集通路，以生成关于m6A修饰改变与EMs潜在分子联系的假设，同时指出数据不能确立因果关系。既往研究表明"MAPK信号通路"激活促进细胞增殖和凋亡，加速EMs形成；"免疫和代谢通路"中众多分子参与疾病发病机制；子宫内膜异位细胞中胰岛素样生长因子2（IGF-2）表达增加，胰岛素样生长因子2反义RNA（IGF2-AS）通过激活"PI3K/AKT/mTOR通路"增强IGF-2表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭。本研究中若干差异表达基因同时表现差异表达和甲基化，其富集通路包括"MAPK信号通路""代谢通路"和"PI3K/AKT/mTOR通路"，与上述EMs相关热点通路对应，支持这些基因可能参与疾病发生发展的假设。Turku数据库验证证实RHOA、FGFR1和KCNA2在卵巢EMs中异常表达；抑制RHOA/ROS轴可缓解EMs，FGFR1表达升高与EMs疼痛相关，KCNA2在EMs中的作用尚未完全确立，但其与其他研究中疼痛的关联提示其可能成为EMs疼痛管理的潜在靶点。此外，研究人员鉴定出一组差异表达的lncRNA，可能与m6A修饰相关；EMs中m6A相关lncRNA研究有限，Liu等近期的m6A全转录组分析鉴定了参与卵巢EMs发展的关键m6A修饰lncRNA，其发现还揭示m6A调节因子ALKBH5介导lncRNA UBOX5-AS1在EMs进展中的作用；本研究主要作为筛选性研究，未来研究旨在阐明m6A相关lncRNA在EMs中功能的机制。关键的是，实验鉴定出5个m6A调节因子，经GSE7305数据库验证最终确认WTAP和RBM15表达显著改变。WTAP通常与METTL3和METTL14共同形成m6A甲基转移酶复合物；METTL3和METTL14在EMs中的作用已被广泛研究，例如Wang等证明METTL3通过SIRT1 mRNA修饰增强细胞衰老抑制EMs发展，Liang等报道组蛋白乳酰化水平升高通过METTL3调控的HIF1A/HMOX1信号通路介导EMs铁死亡抵抗，Shen等观察到METTL3和METTL14在EMs模型中促进细胞增殖和侵袭，Li等显示METTL14/YTHDF2 m6A轴通过调节KLF4稳定性抑制M2巨噬细胞极化；鉴于WTAP与METTL3和METTL14的关联，WTAP可能参与EMs发病机制，2023年一项研究报道WTAP多态性与中国女性卵巢EMs易感性相关。RBM15属于SPEN蛋白家族，与剪接体组分相互作用结合RNA，尽管缺乏催化活性，仍引导METTL3和WTAP至特定RNA位点进行m6A修饰；既往研究表明RBM15通过m6A修饰调控靶基因稳定性促进肿瘤进展；考虑到EMs的肿瘤样特征尤其是侵袭和黏附特性，RBM15在EMs中的作用值得进一步研究。为评估WTAP和RBM15在EMs中的表达水平，研究人员采用qPCR、免疫组织化学和免疫荧光检测，发现与正常子宫内膜相比，EI中WTAP和RBM15表达降低，印证了初步假设；但当前实验仅证明WTAP和RBM15在异位子宫内膜异位病灶与正常子宫内膜之间的差异表达，不能确认其功能参与m6A依赖性调控，需进一步功能研究确定WTAP和RBM15是否参与m6A依赖性调控过程。本研究为探索性筛选分析，观察到的分子差异可能受年龄、组织来源和细胞组成变异等混杂因素影响，不能完全归因于EMs中的m6A改变；未来需要更大样本队列纳入患者在位和异位子宫内膜组织的研究，以剖析这些m6A调节因子参与EMs发病机制的精确机制；此外需要细胞实验和动物模型验证这些调节因子的下游靶点；任何转化或治疗意义在此阶段仍属推测，需在后续研究中严格验证。结论部分翻译：总之，本研究作为探索性筛选分析，刻画了子宫内膜异位症组织中m6A调节因子及相关lncRNA的异常表达模式；本研究鉴定的分子谱在初步描述性研究范围内总体可靠；重要的是，所有观察到的m6A调节因子、候选基因与子宫内膜异位症之间的关联应严格解释为相关性发现，不应推断直接因果关系或确定的功能参与；本研究应明确承认若干局限性，包括样本量相对较小、人子宫内膜组织潜在的临床和细胞异质性以及缺乏体外或体内功能验证；因此需要进一步的大样本队列验证和系统的功能实验，以阐明这些m6A相关分子在子宫内膜异位症发病机制中的精确作用。
