《Genes》：Cross-Dataset Transcriptomics Prioritize Histone-Modifier Candidates for Drought-Response Studies in Carex littledalei
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背景/目标：大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）W3110是重组蛋白生产的常用宿主。然而，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）内毒素污染给生物治疗性蛋白的下游纯化和安全性检测带来了额外挑战。本研究旨在通过编辑脂质A
背景/目标：大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）W3110是重组蛋白生产的常用宿主。然而，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）内毒素污染给生物治疗性蛋白的下游纯化和安全性检测带来了额外挑战。本研究旨在通过编辑脂质A合成基因构建低内毒素大肠杆菌突变株，并进一步测试其生长曲线、内毒素水平以及生产重组抗vWF-A1蛋白的能力。方法：采用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，对大肠杆菌W3110脂质A合成中的两个关键基因lpxM和lpxL进行单独及组合敲除。研究人员表征了细菌生长动力学，测定了LPS内毒素活性，在野生型和突变株中表达了抗vWF-A1蛋白，并量化了纯化抗vWF-A1制备物的蛋白产量和残留内毒素。结果：成功构建了W3110ΔlpxM、W3110ΔlpxL和W3110ΔlpxMΔlpxL三个突变株。lpxL的缺失（单独或与lpxM组合）延长了延迟期并降低了最大比生长速率，而ΔlpxM仅表现出轻微的生长缺陷；所有菌株均达到相似的最终生物量。突变株中的LPS内毒素显著降低，其中ΔlpxMΔlpxL双突变株降低了92.1%。在表达抗vWF-A1时，突变株纯化蛋白中的内毒素显著减少，各菌株的蛋白产量相当（202–210 mg/L，为野生型产量的96.2%–99.5%）。结论：敲除lpxM和lpxL可有效降低内毒素负荷，且不会显著影响重组抗vWF-A1的生产力。该基因编辑策略为工程化低内毒素大肠杆菌底盘菌株用于重组治疗性蛋白生产提供了一条可行途径。
论文解读
大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）作为经典的革兰氏阴性表达宿主，因生长迅速、遗传操作简便、培养成本低廉而被广泛用于重组蛋白、单克隆抗体和疫苗等生物制品的生产。然而，其外膜中的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）即内毒素，是下游纯化与安全性评价的主要障碍。LPS可诱导强烈的炎症反应甚至感染性休克，因此重组药物蛋白中残留内毒素必须严格控制。传统的内毒素去除方法成本高且难以彻底清除。在分子层面减少内毒素的合成，成为构建低内毒素底盘菌株的更直接策略。
LPS由脂质A、核心多糖和O-抗原三部分组成，其中脂质A是内毒素毒性的主要结构决定簇。在大肠杆菌中，脂质A的生物合成需至少九种酶协同完成，包括LpxA、LpxB、LpxC、LpxD、LpxH、LpxK、LpxM、LpxL和KdtA。其中LpxL和LpxM负责催化脂质A骨架上最后两条次级脂肪酸链的连接，酰基链数目直接决定LPS通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）激活炎症反应的强度。已有报道表明，五乙酰化脂质A的TLR4激动活性显著低于六乙酰化，而四乙酰化形式几乎无促炎活性。因此，通过敲除lpxL和lpxM以减少脂质A的酰化程度，有望在基因水平上降低内毒素活性。
针对上述问题，研究人员采用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，对E. coli W3110的脂质A合成基因进行逐一敲除，以探索可存活且内毒素水平降低的最小基因编辑组合。研究发现，在筛选条件下，仅有lpxM和lpxL单基因缺失株以及lpxM/lpxL双缺失株能够存活。研究人员进一步系统评估了这些突变株的生长动力学、LPS内毒素活性、诱导的炎症反应以及重组抗vWF-A1蛋白的生产能力。该研究的意义在于，用仅两个基因的敲除即可显著降低内毒素负荷，同时保持与野生型相当的重组蛋白产量，为工业级低内毒素大肠杆菌底盘菌株的构建提供了新思路。
关键技术方法上，研究人员使用pCas/pTargetF CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑，通过λ-Red重组辅助同源重组，实现lpxM和lpxL的单独及组合敲除。细菌生长动力学通过测定600 nm波长下的光密度（OD
600）并拟合Baranyi-Roberts模型来获取延迟期（λ）和最大比生长速率（μ
max）。内毒素活性采用终点显色法鲎阿米巴样细胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测。LPS提取采用热酚法，并通过SDS-PAGE银染分析其分子量分布。炎症反应评估使用人单核细胞白血病细胞系THP-1（购自ATCC）和SPF级C57BL/6雌性小鼠（购自河南省实验动物中心）。重组抗vWF-A1蛋白经SPFF阳离子交换层析纯化，采用BCA法测定蛋白浓度。
研究结果部分，研究人员报告了以下发现：
3.1 低内毒素E. coli W3110突变株的构建：通过CRISPR/Cas9逐一敲除九个脂质A合成基因，仅lpxM和lpxL缺失株可存活，并进一步构建了双缺失株ΔlpxMΔlpxL。菌落PCR和Sanger测序确认了基因缺失的正确性。
3.2 W3110突变株的生长特性：通过OD
600监测生长曲线并拟合模型，发现lpxL缺失（单缺失或与lpxM双缺失）显著延长延迟期并降低μ
max，而ΔlpxM仅引起轻微生长迟滞。所有菌株最终生物量无显著差异，提示双基因敲除对整体发酵产量影响有限。
3.3 野生型W3110和突变株的内毒素活性：培养上清和纯化LPS的LAL测定显示，突变株内毒素活性显著下降。与野生型相比，ΔlpxM上清液内毒素降低60.7%，ΔlpxL降低45.2%，ΔlpxMΔlpxL降低66.7%；纯化LPS的活性分别降低84.3%、75.5%和92.1%。银染SDS-PAGE显示突变株LPS缺失了40–120 kDa的典型梯形条带，仅保留14–30 kDa的两条主带，提示LPS分子结构发生了修饰。
3.4 突变株LPS触发的炎症反应：在PMA分化的THP-1细胞中，突变株LPS诱导的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平显著低于野生型LPS。双突变株LPS使TNF-α降低97.6%，IL-6降低85.2%。小鼠模型中，经腹腔注射突变株LPS后，血清TNF-α和IL-6水平同样显著降低，其中双突变株使TNF-α降低73.8%，IL-6降低91.8%，表明lpxM和lpxL缺失有效减弱了LPS的体内促炎活性。
3.5 突变株中的蛋白表达及纯化蛋白内毒素分析：将编码抗vWF-A1的质粒转化至各菌株并诱导表达，纯化后的蛋白产量在各菌株间无统计学差异：野生型为210 mg/L，ΔlpxM为209 mg/L，ΔlpxL为205 mg/L，ΔlpxMΔlpxL为202 mg/L，分别相当于野生型的100%、99.5%、97.6%和96.2%。纯化蛋白中残留内毒素含量以每毫克蛋白的内毒素单位（EU/mg）计，野生型为1.06 EU/mg，ΔlpxM为0.22 EU/mg（降低79.1%），ΔlpxL为0.76 EU/mg（降低28.9%），ΔlpxMΔlpxL为0.17 EU/mg（降低84.0%），证明双基因敲除可在不影响蛋白产量的前提下显著降低产物内毒素污染。
讨论部分总结道，与以往需要七个基因缺失并引入补偿性msbA突变的解毒菌株策略相比，本研究仅敲除两个基因即可实现内毒素的大幅降低，且遗传背景更简单，便于后续合成生物学改造。细胞和动物模型证实，突变株LPS诱导的炎症反应显著减弱。但研究也指出，银染SDS-PAGE不能直接测定脂质A酰化程度，且动物实验中采用等质量而非等内毒素剂量给药，因此需进一步实验区分结构变化与剂量效应对炎症结果的影响。此外，本研究仅在摇瓶水平验证，未来需进行生物反应器规模放大和跨菌株验证。
研究结论翻译如下：利用CRISPR/Cas9基因组编辑，通过敲除lpxM和lpxL构建了低内毒素大肠杆菌W3110单突变株和双突变株。ΔlpxMΔlpxL双突变株表现出轻微生长延迟但维持了野生型水平的生物量。这些突变株的LPS表现出改变的分子量模式并降低了内毒素活性。在突变株中产生的重组抗vWF-A1蛋白每毫克纯化蛋白的残留内毒素更少，而纯化产量与野生型相当（202–210 mg/L培养物），且突变株来源的LPS在细胞和小鼠模型中诱导了减弱的炎症反应。与以往报道的多基因修饰低内毒素菌株相比，该策略仅需两个基因缺失。由于本研究在W3110菌株的摇瓶实验中进行，未来还需要生物反应器规模的发酵和跨菌株验证。该工作为降低重组蛋白生产中大肠杆菌底盘菌株的内毒素负荷提供了概念验证性的基因工程策略。
