囊性纤维化患者痰液中 PMA 处理 DNA 与 RNA 16S 扩增子测序比较研究

《ISME Communications》：Comparison of PMA-treated DNA and RNA-based 16S rRNA amplicon sequencing for viable bacterial profiling in patients with Cystic Fibrosis.

摘要

16S rRNA基因扩增子测序仍然是微生物组研究中最常用的技术。然而，传统的16S rRNA基因扩增子测序无法区分活菌和死菌，而这对于理解细菌群落动态以及指导囊性纤维化（CF）的治疗非常重要。两种常用的针对活性菌群的策略是使用丙胺甲基酰亚胺（PMA）对DNA进行预处理，以及基于RNA的（cDNA）测序。然而，在CF患者的痰液中直接比较这两种方法的效果尚未经过系统的评估。

我们分析了41份痰液样本，这些样本分别来自临床稳定期（n=26）和急性加重期（n=15）。每对样本分别经过PMA处理的DNA提取或RNA提取后进行cDNA合成，并进行16S rRNA基因（V4）测序。然后，我们比较了这两种方法得到的细菌群落结构、生态类型和预测的功能谱型。

与基于RNA的谱型相比，经过PMA处理的样本表现出更高的α多样性（p<0.0001）和更低的优势度（p=0.0001），同时在β多样性上也存在显著差异（R2=0.04，p=0.017）。这些差异主要出现在稳定期样本中，而在急性加重期样本中则表现出较高的一致性。共识别出7种细菌群落类型，要么以CF病原体（如铜绿假单胞菌、葡萄球菌、伯克霍尔德菌科）为主，要么以多种口腔共生菌（如链球菌、奈瑟菌、韦永菌、普雷沃氏菌）为主。预处理导致的群落变化主要发生在富含普雷沃氏菌和韦永菌（PMA处理组）或葡萄球菌（RNA处理组）的稳定菌群中。功能预测结果显示，两种方法之间的KEGG同源标识符有28.22%存在显著差异，尤其是与膜转运、能量代谢和群体感应相关的途径。

总体而言，基于RNA的测序所得的16S rRNA扩增子谱型与PMA处理的DNA结果相当，尤其是在以病原体为主的急性加重期样本中。这可能成为CF气道研究中评估活性微生物群的实际替代方法。