《BioDesign Research》：SSAP-mediated recombineering for genome editing and chassis development in lactic acid bacteria
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乳酸菌（LAB）因其系统发育多样性、代谢多功能性、工业鲁棒性及长期安全使用历史，被视为合成生物学极具吸引力的底盘。然而，大多数LAB仍被视为非模式革兰氏阳性菌，其广泛应用长期受限于缺乏高效且广泛适用的遗传工程工具。经典同源重组（HR）为LAB的靶向基因组操作奠
乳酸菌（LAB）因其系统发育多样性、代谢多功能性、工业鲁棒性及长期安全使用历史，被视为合成生物学极具吸引力的底盘。然而，大多数LAB仍被视为非模式革兰氏阳性菌，其广泛应用长期受限于缺乏高效且广泛适用的遗传工程工具。经典同源重组（HR）为LAB的靶向基因组操作奠定了基础，但其实际应用常受编辑效率低和对宿主重组能力高度依赖的限制。噬菌体来源的单链退火蛋白（SSAP）介导的重组工程已成为克服上述局限的有力替代方案，尤其是在部分内源重组活性较差的LAB菌种中。本综述对已开发的LAB基因组编辑策略进行了整合性概述，重点强调SSAP介导的重组工程作为高效基因组工程使能技术的作用。研究人员总结了其原理、SSAP发现、SSAP–SSB兼容性、宿主范围扩展及其在LAB底盘中的应用，进一步讨论了其在推动LAB作为微生物底盘生产高价值化合物方面的作用，并概述了LAB基因组工程当前面临的挑战与未来方向。
**研究背景与意义**
工业生物技术依赖微生物细胞工厂实现化学品、材料及高附加值产品的可持续生产，推动制造业向绿色化转型。尽管大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式微生物仍是微生物工程的核心，但其生理与代谢特性并非总能满足工业应用需求，这促使研究者日益关注具有优良特性的非模式微生物。乳酸菌（LAB）因其长期安全使用历史和广泛代谢多样性而备受瞩目，已从传统发酵微生物逐步转变为合成生物学与代谢工程有前景的底盘。
然而，LAB作为合成生物学平台更广泛应用的主要障碍在于高效可靠基因组编辑工具的匮乏。依赖宿主RecA的同源重组（HR）是LAB靶向基因组操作的主要方法，但存在若干关键局限：通常需要较长的同源臂（约1 kb），增加了实验复杂性并降低了操作灵活性；对宿主内源重组途径的依赖限制了效率，使其不适用于高通量功能基因组学或复杂代谢工程。为此，噬菌体来源的SSAP提供了有前景的解决方案，其重组效率较内源重组可提高1000倍以上。SSAP利用相对较短的同源臂促进单链DNA（ssDNA）在基因组复制过程中的整合，实现修饰的稳定遗传。此外，CRISPR/Cas系统常被用作反向选择工具，通过精确切割未编辑基因组提高正确编辑细胞的回收率，从而扩展了多种LAB菌种的遗传可及性。该综述以SSAP为中心框架，比较不同工具的 recombination机制、对宿主DNA修复的依赖及实际局限，为重组工程如何克服宿主特异性障碍、拓宽LAB遗传可及性提供了机制性与比较性视角。
**关键技术方法**
研究人员主要采用以下关键技术方法开展研究：一是文献整合与比较分析，系统梳理LAB中经典同源重组、CRISPR/Cas辅助编辑及重组工程三大策略的机制与局限；二是SSAP功能驱动的高通量筛选流程，结合条形码SSAP文库、迭代寡核苷酸介导重组循环与新一代测序（NGS）富集高活性重组酶；三是生物信息学与宏基因组挖掘策略，利用已知高活性SSAP的多序列比对构建隐马尔可夫模型（HMM），迭代搜索基因组与宏基因组数据库鉴定RecT、Erf、Sak家族同源物；四是在表征良好的报告基因座（如rpoB、rpsL、pyrF、gyrA）上以选择标记定量等位基因替换频率进行功能验证。样本队列来源为已报道的多种LAB菌种及环境微生物组数据。
**研究结果**
**基因编辑技术在乳酸菌中的发展**：在LAB中，经典HR主要通过自杀载体介导的等位基因交换实现，需两次连续交叉事件，常受重组频率低、筛选工作量大及依赖宿主重组能力限制。为提升实用性，基于正负筛选的无标记编辑策略相继开发，包括sacB热敏自杀载体、突变pheS反向选择系统及YoeB毒素选择盒，显著改善了无标记编辑可行性。CRISPR/Cas系统的可编程靶向能力被重新用于引入位点特异性DNA双链断裂，强烈刺激内源HR修复，在L. crispatus、S. thermophilus、L. lactis等菌种中实现基因缺失、插入及单核苷酸替换，部分效率达100%。但CRISPR/Cas辅助编辑仍根本上依赖宿主DNA修复能力，多数LAB菌株高效修复依赖内源HR而非非同源末端连接，因此精确编辑仍需较长同源臂供体DNA与大量筛选。
**噬菌体来源重组酶介导的重组工程**：重组工程通过提供噬菌体来源重组酶介导DNA复制叉处的退火，促进外源ssDNA整合入基因组。其核心组件为SSAP，催化ATP非依赖性ssDNA退火至复制叉后随链模板；双链DNA重组工程中SSAP与同源噬菌体核酸外切酶（λExo/RecE）协作，将线性供体加工为3′ ssDNA悬突；宿主编码单链DNA结合蛋白（SSB）通过其C端尾部与SSAP直接互作，介导重组酶募集至复制机器，SSAP–SSB互作具有高度种属特异性，是宿主范围的主要决定因素，SSAP–SSB构成ssDNA寡核苷酸介导基因组编辑的最小功能单元。
**单链DNA重组工程**：该策略依赖噬菌体SSAP与宿主SSB协同，不依赖双链断裂，仅需SSAP即可实现精确核苷酸替换、小插入与缺失。典型流程中合成寡脱氧核苷酸（oligos）携带同源臂，电穿孔后与SSAP结合并在复制叉处退火，退火ssDNA引发新生DNA合成，经一轮复制整合入子代染色体。宿主错配修复（MMR）系统是效率的重要决定因素，可通过灭活mutS/mutL或供体设计规避；寡核苷酸末端硫代磷酸修饰可保护其免受核酸酶降解。在LAB中，来自Enterococcus faecalis的高活性RecT在L. lactis rpoB位点实现100%突变率；结合CRISPR/Cas9反向选择在Limosilactobacillus reuteri实现近100%密码子饱和突变回收；L. lactis无缝缺失插入效率达75%。该策略为LAB高通量基因组工程奠定基础。
**双链DNA重组工程**：该策略利用噬菌体重组酶系统（最典型为λ Red操纵子编码Exo、Beta、Gam），Exo为5′-3′核酸外切酶加工线性dsDNA供体，Beta促进链退火，Gam抑制RecBCD降解供体。RecE/RecT为功能类似替代系统，在Levilactobacillus brevis中鉴定出高效RecE/RecT；在Lactiplantibacillus plantarum中表征了功能性Gam–Beta–Exo同源物。在L. casei中Red/RecET样系统与Cre-lox平台结合实现基因组最小化，单次约39.3 kb及同时双缺失均达100%。Huang等将RecE/RecT与CRISPR/Cas9整合为通用工具包，在L. plantarum和L. lactis实现约91%敲除效率。dsDNA重组工程还能克服缺乏高效RecA依赖HR途径的宿主（如S. zooepidemicus）的固有局限。
**新型SSAP与重组工程系统的发现**：经典SSAP如λRedβ和RecT在LAB中常表现窄宿主特异性与可变效率。研究者发展了两种互补策略：功能驱动的高通量筛选流程（条形码SSAP文库、迭代编辑选择、NGS追踪）可快速鉴定高等位基因替换频率（ARF）及部分跨种功能的SSAP；生物信息学与宏基因组挖掘利用HMM迭代搜索鉴定RecT、Erf、Sak家族同源物，经序列聚类优先选择非冗余噬菌体来源重组酶，合成克隆至广宿主范围诱导型载体进行功能验证。整合两种流程可构建扩展宿主兼容性与增强重组效率的稳健框架。但异源SSAP的可移植性并非仅由表达或序列相似性决定，而取决于SSAP与宿主复制环境的兼容性，特别是SSAP–SSB互作，需实验评估而非仅依赖序列预测。
**基因组编辑驱动乳酸菌走向合成生物学底盘**：LAB正从传统发酵剂与益生菌发展为可编程微生物底盘。在S. thermophilus中靶向缺失ldhD及larA–E操纵子将碳流导向L-乳酸合成，产量86.8 g/L、光学纯度99.4%；在Lacticaseibacillus paracasei中CRISPR/Cas9辅助HR结合代谢工程构建高效L-乳酸生产者，滴度达220 g/L，超过大肠杆菌等模式微生物；CRISPRi调控增强S. thermophilus胞外多糖生产；在Pediococcus acidilactici中整合异源木糖利用途径结合pkt缺失与适应性实验室进化实现高效D-乳酸生产；在Leuconostoc citreum中CRISPRi抑制ribF和folE改善核黄素 biosynthesis；RecT辅助CRISPR/Cas9编辑无需外源质粒即改善透明质酸生产。这些研究表明基因组编辑已驱动LAB走向可工程化合成生物学底盘。
**讨论与结论**
综述指出，基因组编辑技术的发展显著加速了LAB从传统发酵微生物向合成生物学可工程底盘转变，CRISPR辅助编辑与重组工程大幅扩展了LAB遗传工具箱并提升其代谢工程效用，已实现多种高价值化合物细胞工厂构建。尽管如此，LAB遗传工程工具箱仍不及大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等经典模式与工业微生物成熟；目前乳酸球菌属和乳杆菌属工程化最深入，而许多非模式、野生型及工业相关LAB仍缺乏高效广泛适用编辑平台，受限于转化效率、菌株特异性DNA修复能力及宿主兼容工具不足。经典RecA介导HR因广泛适用性与高准确性仍具重要性，但效率低与流程繁琐限制其实用；CRISPR辅助HR改善了选择性与可编程性，但性能仍强依赖内源DNA修复途径；相比之下，基于噬菌体SSAP的重组工程因更高重组效率与更短同源序列需求，成为高效基因组工程尤为有前景的路线。未来进展将取决于具有更广宿主兼容性的新型SSAP发现与优化、SSAP–宿主互作机制深入理解，以及重组工程与CRISPR选择、代谢工程和高通量菌株设计整合平台的开发；将这些策略扩展至多样非模式与工业LAB，对将方法学进展转化为实际底盘开发至关重要。随着基因组编辑技术持续创新，LAB有望成为合成生物学、可持续生物制造及高价值生物产品生产日益重要的平台。
