《Biofilm》：Single-cell counting reveals a modest, nutrient-dependent growth advantage of early
Pseudomonas fluorescens biofilms over planktonic cells
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微生物生物被膜（biofilms）是嵌入自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中的表面附着群落。其对环境胁迫因子和抗微生物制剂的耐受性构成了持续性临床感染、工业生物污损以及自然环境存活的基础。生物被膜相关细胞与浮游细胞在生理学和基因表达方面存在显著差异。然而，这些
微生物生物被膜（biofilms）是嵌入自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中的表面附着群落。其对环境胁迫因子和抗微生物制剂的耐受性构成了持续性临床感染、工业生物污损以及自然环境存活的基础。生物被膜相关细胞与浮游细胞在生理学和基因表达方面存在显著差异。然而，这些差异是否延伸至生长速率，数十年来一直存在争议：早期研究报道称附着于表面既可刺激也可抑制细菌活性。这一问题至今仍未得到充分解决，部分原因在于这两种生活方式很少采用可比方法进行评估。营养环境是生物被膜形成的最强影响因素之一。在Pseudomonas fluorescens WCS365中，在非生物表面启动生物被膜的能力取决于可用的营养物质，且不同营养物质通过不同的、趋同的调控途径发挥作用。在P. fluorescens Pf0-1中，磷酸盐限制降低细胞内c-di-GMP水平并阻断黏附素LapA向细胞表面的分泌，从而阻止生物被膜形成。在P. aeruginosa中，群体感应是否为生物被膜发育所必需取决于碳源。此外，琥珀酸、谷氨酸或葡萄糖等碳底物的突然增加会触发生物被膜分散。这些研究大多测量了初始附着、总生物被膜生物量、生物被膜结构、分散或 underlying 信号通路等参数。特定营养物质如何影响细胞在生物被膜内的生长速率，以及这是否与相同条件下的浮游生长不同，受到的关注要少得多。造成这一知识缺口的部分原因是方法学上的。生物被膜形成最常被量化为总附着生物量，例如通过结晶紫染色，或作为从共聚焦图像获取的生物体积和厚度。这些测量包括基质并依赖于细胞大小，而结晶紫染色等终点测定不提供生长速率。相反，浮游生长通常通过光密度（OD）或菌落计数来监测，报告的是悬浮液中的种群生物量或活细胞数。因此，两种生活方式之间的比较往往依赖于用不同方法测量的不同量。计数生物被膜内的单个细胞将提供生物被膜种群生长的直接测量，但密集的三维生物被膜难以分割成单个细胞。共聚焦显微镜和基于深度学习的图像分割的最新进展使得计数早期生物被膜内的细胞并测量其生长速率成为可能。Pseudomonas fluorescens是土壤、植物表面和水的广泛定殖者，也是表面定殖和早期生物被膜形成的成熟模型。在本研究中，研究人员使用单细胞共聚焦成像和自动分割，从细胞计数测量表面附着的P. fluorescens WCS365的比生长速率，并将其与在相同培养基中生长的浮游培养物进行比较。浮游生长通过OD测量，并针对活细胞计数进行验证。酪蛋白氨基酸（CAA）是酪蛋白的酸水解物，通常添加到生物被膜测定中的基础培养基中，但它们也提供氨基酸作为额外的碳源和氮源，且单个氨基酸可以调节Pseudomonas中的表面相关行为。因此，在三种碳源（葡萄糖、甘油和琥珀酸）以等摩尔碳浓度供应、添加或不添加CAA补充的条件下比较生长，以检验附着细胞和浮游细胞的相对生长是否取决于营养环境。最后，在8 h测定结束时表征生物被膜结构，以检查生长差异是否反映在生物被膜结构中。
**研究背景与问题**
微生物生物被膜是嵌入自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中的表面附着群落，其对抗微生物制剂和环境胁迫因子的耐受性构成了持续性临床感染、工业生物污损及自然环境存活的重要基础。生物被膜相关细胞与浮游细胞在生理学和基因表达方面存在显著差异，但这种差异是否延伸至生长速率，数十年来一直存在争议。早期研究报道称表面附着既可刺激也可抑制细菌活性，然而这一问题至今仍未得到充分解决，部分原因在于两种生活方式很少采用可比方法进行评估。营养环境是生物被膜形成的最强影响因素之一，在
P. fluorescens WCS365中，生物被膜启动能力取决于可用营养物质，且不同营养物质通过不同的调控途径发挥作用。然而，现有研究大多测量初始附着、总生物被膜生物量、生物被膜结构或分散等参数，关于特定营养物质如何影响生物被膜内细胞生长速率、以及这是否与相同条件下的浮游生长不同，受到的关注甚少。造成这一知识缺口的部分原因是方法学上的：生物被膜形成最常被量化为总附着生物量（如结晶紫染色）或共聚焦图像获取的生物体积和厚度，这些测量包括基质且不提供生长速率；而浮游生长通常通过光密度（OD）或菌落计数监测。两种生活方式之间的比较往往依赖于用不同方法测量的不同量。计数生物被膜内的单个细胞将提供生物被膜种群生长的直接测量，但密集的三维生物被膜难以分割成单个细胞。共聚焦显微镜和基于深度学习的分割技术的最新进展使得计数早期生物被膜内的细胞并测量其生长速率成为可能。基于此，研究人员开展了本研究，旨在使用单细胞共聚焦成像和自动分割技术，从细胞计数测量表面附着的
P. fluorescens WCS365的比生长速率（μ），并与在相同培养基中生长的浮游培养物进行比较，同时检验这种相对生长是否取决于营养环境（三种碳源、添加或不添加CAA），并在8 h测定结束时表征生物被膜结构以检查生长差异是否反映在结构特征中。
**关键技术方法**
研究人员采用单细胞共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像结合基于StarDist的深度学习分割流程（优化后处理，OPP）对早期生物被膜内的单个细胞进行三维分割和计数，并通过BiofilmQ软件提取细胞数量和生物被膜结构参数。浮游生长通过光密度（OD600）测量，并针对菌落形成单位（CFU）进行验证。比生长速率通过指数期细胞数或校正OD600的自然对数对时间的线性回归斜率估算。生物被膜结构参数采用线性混合效应模型比较，生长速率采用广义最小二乘模型分析。实验使用
P. fluorescens WCS365菌株，在M9基础培养基中以葡萄糖、甘油或琥珀酸为初级碳源（等摩尔碳浓度120 mM C），添加或不添加0.2%（w/v）CAA，共6种条件，每种条件3个独立生物学重复。
**研究结果**
**碳源对早期生物被膜形成的影响**：通过逐小时固定、清洗和SYTO 9染色后CLSM成像，研究人员发现所有培养基条件下表面附着细胞数在8 h内持续增加。添加CAA时，8 h生物被膜每菌落细胞数（均值±标准差）为葡萄糖1677±621、甘油1323±370、琥珀酸386±123；不添加CAA时菌落小得多，8 h平均为葡萄糖80、甘油21、琥珀酸54个细胞。自动分割与人工标注高度一致（30个验证图像栈中精确率0.92、召回率0.81、F1为0.86），自动计数平均低于人工计数11%，但该低估随时间恒定，对比生长速率仅改变?0.010 h?1。
**跨碳源生物被膜结构特性的定量分析**：通过BiofilmQ分析8 h添加CAA的生物被膜结构参数，研究人员发现生物被膜体积在葡萄糖中最高（2717±976 μm3）、甘油居中（2028±554 μm3）、琥珀酸最低（617±188 μm3），各碳源间差异显著；基底面积呈类似趋势但分离程度较低，琥珀酸显著小于葡萄糖和甘油，而葡萄糖与甘油无显著差异；生物被膜高度则以甘油最高（9.9±1.7 μm）、葡萄糖居中（8.9±1.6 μm）、琥珀酸最矮（7.6±1.3 μm），甘油显著高于葡萄糖和琥珀酸。细胞堆积指标方面，琥珀酸生物被膜的最近邻距离最大（1.29±0.11 μm），显著大于葡萄糖（1.14±0.03 μm）和甘油（1.11±0.03 μm）；而细胞间间距在琥珀酸中最小（0.567±0.010 μm），显著小于葡萄糖（0.593±0.008 μm）和甘油（0.585±0.009 μm），甘油又略小于葡萄糖。
**生物被膜生长动力学的定量分析**：通过对数转换细胞数对时间的回归，研究人员发现添加CAA时葡萄糖生物被膜比生长速率最快（μ=1.193±0.056 h?1，倍增时间td=0.581 h），甘油居中（μ=1.032±0.064 h?1，td=0.672 h），琥珀酸最慢（μ=0.953±0.096 h?1，td=0.727 h），回归拟合决定系数高（平均R2=0.971–0.995）。不添加CAA时所有碳源中生物被膜生长均减慢：葡萄糖仍最快（μ=0.521±0.001 h?1），但琥珀酸（μ=0.490±0.025 h?1）超过甘油（μ=0.350±0.028 h?1），甘油与琥珀酸的顺序与添加CAA时相反。
**等效营养条件下的浮游生长动力学**：通过在摇瓶中每小时测量OD600，研究人员发现添加CAA时浮游μ的碳源顺序与生物被膜一致：葡萄糖最高（0.982±0.010 h?1，td=0.706 h）、甘油居中（0.915±0.076 h?1，td=0.757 h）、琥珀酸最低（0.849±0.029 h?1，td=0.817 h），R2=0.991–0.999。不添加CAA时浮游生长减慢：葡萄糖μ=0.571±0.023 h?1、琥珀酸μ=0.386±0.041 h?1；甘油不添加CAA时8 h内未检测到OD600增加。稀释系列中OD600略低于与细胞密度的正比关系（log-log斜率0.94），但在生长培养物中CFU/OD600单位在2–6 h间无变化（每小时0.05%，p=0.98），CFU与OD600估算的比生长速率无差异（平均差?0.03 h?1，95% CI ?0.11至+0.05），表明OD600在拟合窗口内跟踪活细胞数。添加CAA的生物被膜中，3–7 h间每个分割细胞的平均体积为1.4–1.6 μm3，碳源间差异小于3%。
**生物被膜与浮游生长速率的比较**：通过广义最小二乘模型分析，研究人员发现添加CAA时生物被膜比生长速率平均比浮游高15%（95% CI 7–24%，p=0.002），且该差异不显著依赖碳源（生活方式×碳源交互作用p=0.42）。各碳源单独比较时生物被膜生长速率分别高21%（葡萄糖）、13%（甘油）、12%（琥珀酸），但多重比较校正后均不显著。碳源间生长速率存在差异（p=0.015），两种生活方式中顺序一致（葡萄糖>甘油>琥珀酸），但校正后无单个碳源对显著不同。比较依赖拟合窗口：添加CAA时生物被膜在2–6、2–7和2–8 h窗口的生长速率与3–7 h相差最多10%，而浮游生长速率在窗口延伸超出指数期时下降最多25%；若对两种生活方式应用相同窗口（截至7或8 h），葡萄糖和甘油中生物被膜优势增至30–51%，但这些共同窗口包含浮游生长的减速阶段，故研究在各自指数期内比较生长速率。去除CAA同时保持总碳恒定降低了所有条件下的比生长速率：生物被膜在葡萄糖中降56%、甘油降66%、琥珀酸降49%，浮游在葡萄糖中降42%、琥珀酸降54%；甘油不添加CAA时浮游无OD600增加而附着细胞以0.350 h?1生长。不添加CAA时，葡萄糖中生物被膜生长速率比浮游低9%、琥珀酸中高27%，均不显著（校正p=0.30和0.21）。去除CAA使葡萄糖中生物被膜/浮游生长速率比降低25%（95% CI 14–34%，校正p=0.003），琥珀酸中变化（+14%）不显著（校正p=0.43）。
**讨论部分总结**
讨论部分围绕四个层面展开。第一，关于浮游与生物被膜种群的比较生长动力学，研究人员指出添加CAA时表面附着的
P. fluorescens平均比浮游细胞生长快15%，且不显著依赖碳源；固定2–8 h窗口所提示的更大且依赖底物的差异源于该窗口包含了浮游培养物在5–6 h后的减速而附着细胞持续指数生长至7 h。虽然两种生活方式采用不同方法测量（生物被膜用细胞计数、浮游用OD600），但OD600在拟合窗口内跟踪CFU，因此附着细胞的较快生长不太可能反映OD600作为细胞数替代指标的偏差，尽管浮游细胞大小或聚集差异不能排除。早期研究认为附着不赋予固有、一致的代谢优势，差异取决于基质、底物供应和局部环境变化而非黏附本身；即使Fletcher报道的附着
P. fluorescens葡萄糖同化高2–5倍后来也被归因于自由生活细胞的底物耗竭。本研究中浮游生长速率仅在指数期估算，底物耗竭不太可能解释附着细胞的适度优势；可能的解释包括生物被膜内局部细胞密度更高、邻近细胞释放的代谢物可被共享，以及通过c-di-GMP信号传导的表面感知，但二者均未在本研究中检验。第二，关于碳源和CAA对生长速率的影响，添加CAA时两种生活方式中生长速率顺序一致（葡萄糖>甘油>琥珀酸），这与各底物进入中心代谢接近己糖磷酸的程度一致；在相关物种
P. putida中，葡萄糖主要转化为6-磷酸葡萄糖酸并通过Entner-Doudoroff途径分解代谢，甘油在磷酸丙糖水平进入并引发糖异生反应以再生己糖磷酸，琥珀酸进入三羧酸循环致使己糖磷酸前体须经完整糖异生途径再生，但该解释未经直接检验。尽管总碳匹配，不添加CAA时所有检测到生长的条件下生长速率降低42–66%，CAA主要作为营养补充，最可能通过提供预制氨基酸发挥作用；添加CAA培养基中的生长反映初级碳源和CAA的综合效应。不添加CAA时附着细胞在琥珀酸中比甘油中生长更快（0.490 vs 0.350 h?1），故上述顺序仅在CAA存在时成立。若CAA主要通过分解代谢物阻遏抑制初级碳源分解代谢，其去除应增加葡萄糖和甘油中的生长，但未观察到。不添加CAA时葡萄糖中生物被膜优势丧失，而甘油中附着细胞生长而8 h内未检测到OD600增加，表明两种生活方式的关系取决于营养环境。第三，关于碳源对生物被膜结构特性的影响及胞外基质的作用，8 h时生物被膜结构因碳源而异；生物被膜体积和基底面积遵循生长速率顺序（葡萄糖生物被膜体积为琥珀酸的4.4倍、比甘油大34%），与较快的生长在相同时间内产生更多细胞一致；其他指标不遵循此顺序：甘油生物被膜最高（比葡萄糖高11%、比琥珀酸高31%），琥珀酸生物被膜最近邻距离大14–16%提示细胞在表面分布更稀疏但共处时堆积至少同样紧密（细胞间间距更小）。部分差异可能反映胞外基质而非细胞本身；细菌生物被膜基质主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成，将细胞保持在一起并附着于表面；在
P. fluorescens WCS365中不可逆附着需要大表面黏附素LapA，在
P. fluorescens Pf0-1中其细胞表面定位受磷酸盐可用性通过c-di-GMP信号控制；碳源还可影响
Pseudomonas物种产生的胞外多糖量，甘油促进
P. aeruginosa表面附着并改变菌落形态；由于基质占据细胞间空间并介导细胞–细胞相互作用，可决定细胞堆积紧密程度和生物被膜高度生长，在
Vibrio cholerae中生物被膜的局部有序和整体结构源于此类基质依赖的细胞–细胞相互作用；因此碳源依赖的基质产生或组成差异可能独立于生长速率促成甘油生物被膜更高和琥珀酸生物被膜更分散的排列；本研究所有结构指标均从分割细胞计算，不包括基质（本研究未染色），故该可能性尚待检验。第四，关于更广泛的生态和应用意义，在根际等自然环境中细菌可利用的营养物质随时间变化（如根分泌物的组成随植物发育而改变），本研究结果提示此类环境中附着细胞和自由生活细胞的相对生长并非固定不变而是取决于可用营养物质，且碳源以不能仅由生长速率解释的方式塑造生物被膜结构；因此管理系统的营养组成可补充其他策略以控制不良环境（如工业生物污损）或有益环境（如废水处理）中的生物被膜生长和结构。局限性方面：研究使用单一菌种和菌株，结果对其他分类群的普适性不确定；聚焦静态条件下早期生物被膜，未涉及结构异质性和营养限制可能改变生长动力学的后期成熟阶段；两种生活方式采用不同方法测量，未直接测量浮游细胞大小、形态和聚集；每小时采样使添加CAA的浮游培养物指数期仅含4或5个时间点，比较依赖拟合窗口；未测量氨基酸摄取、分解代谢物阻遏和生物合成途径活性，CAA效应的机制部分未解决；EPS未染色或定量，其结构差异贡献无法评估；每组3个生物学重复对单个碳源差异的检验效能有限。未来研究方向包括：直接测量两种生活方式中的底物和氨基酸摄取及生物量产量（Y
X/S）、用报告基因或转录组测量受分解代谢物阻遏蛋白Crc和Hfq调控的基因、用相同分割流程成像浮游细胞以直接比较细胞大小并从总生物体积计算生长速率、与细胞同时染色EPS和黏附素并定量各碳源中的基质产生、将该方法扩展至流动条件、一系列底物浓度和其他
P. fluorescens菌株。
**研究结论**
本研究使用单细胞共聚焦成像计数早期生物被膜内的细胞，比较了表面附着和浮游
P. fluorescens WCS365在葡萄糖、甘油和琥珀酸中（添加或不添加CAA）的生长动力学。添加CAA时，附着细胞平均比浮游细胞生长快15%，且该差异不显著依赖碳源。去除CAA降低了两种生活方式的生长并消除了葡萄糖中的生物被膜优势，表明两种生活方式之间的关系取决于营养环境而非仅取决于附着。碳源还塑造了生物被膜结构：生物被膜体积和基底面积遵循生长速率顺序（葡萄糖>甘油>琥珀酸），与较快的生长产生更多细胞一致，而生物被膜高度和最近邻距离不遵循此顺序，提示生长速率以外的因素（如EPS）促成了早期
P. fluorescens生物被膜的空间组织。
