《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Integrative transcriptomic and single-cell analysis identifies a manganese-associated transcriptional signature and a potential JUN/HBEGF-associated endothelial signature in COPD pulmonary vascular remodeling
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慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续呼吸道症状和慢性气流受限为特征的异质性临床综合征。除气道炎症和肺气肿性破坏外，肺血管重构是COPD的重要病理特征，主要累及小口径血管，包括内膜增厚、间充质细胞增殖、细胞外基质沉积和内皮功能障碍。吸烟是COPD的主要环境危
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续呼吸道症状和慢性气流受限为特征的异质性临床综合征。除气道炎症和肺气肿性破坏外，肺血管重构是COPD的重要病理特征，主要累及小口径血管，包括内膜增厚、间充质细胞增殖、细胞外基质沉积和内皮功能障碍。吸烟是COPD的主要环境危险因素，烟草和香烟烟雾含有多种金属元素，其中锰（Mn）浓度相对较高，提示吸烟可能是Mn暴露的重要来源。Mn虽为必需微量元素，但过量暴露与氧化应激、炎症激活和细胞毒性相关。实验研究显示，吸入或可溶性Mn可改变与缺氧和血管生成相关的肺基因表达，并激活与肺部炎症相关的缺氧通路，但这些效应与COPD中Mn相关分子反应对肺血管重构的潜在贡献尚不充分明确。肺血管内皮细胞维持血管屏障完整性、调节血管张力并协调炎症反应，内皮功能障碍是COPD的重要特征并可能早期出现。香烟烟雾和慢性炎症刺激可诱导内皮损伤和激活，导致血管舒张受损、促炎表型和凋亡，进而促进毛细血管丢失、平滑肌细胞增殖、细胞外基质沉积和肺血管重构。JUN是激活蛋白-1（AP-1）转录因子复合体的关键组分，调控炎症、应激反应、凋亡和组织重构，JUN/AP-1信号改变与吸烟相关肺部炎症和肺气肿性改变有关。肝素结合表皮生长因子样生长因子（HBEGF）亦与COPD相关气道重构、纤维化和上皮-间质转化有关。本研究整合COPD相关批量与单细胞转录组数据集，采用锰相关基因评分、差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基于机器学习的生物标志物筛选、分子分型和单细胞分析，旨在鉴定锰相关分子特征及与肺血管重构相关的关键调控候选因子，重点关注HBEGF及其与JUN活性和内皮-平滑肌通讯的潜在关系。
研究背景方面，慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以持续呼吸道症状和慢性气流受限为特征的异质性临床综合征，肺血管重构是其重要病理特征，主要累及小口径血管，表现为内膜增厚、间充质细胞增殖、细胞外基质沉积和内皮功能障碍。吸烟是COPD主要环境危险因素，烟草中锰（Mn）浓度相对较高，提示吸烟可能是Mn暴露的重要来源。Mn虽为必需微量元素，但过量暴露与氧化应激、炎症激活和细胞毒性相关，实验研究显示吸入或可溶性Mn可改变缺氧和血管生成相关肺基因表达并激活缺氧相关通路。然而，Mn相关分子反应对COPD肺血管重构的潜在贡献尚不充分明确。肺血管内皮细胞维持血管屏障完整性、调节血管张力并协调炎症反应，内皮功能障碍是COPD重要特征且可能早期出现，香烟烟雾和慢性炎症刺激可诱导内皮损伤和激活，进而促进毛细血管丢失、平滑肌细胞增殖、细胞外基质沉积和肺血管重构。JUN作为激活蛋白-1（AP-1）转录因子复合体关键组分，调控炎症、应激反应、凋亡和组织重构，其信号改变与吸烟相关肺部炎症和肺气肿性改变有关；肝素结合表皮生长因子样生长因子（HBEGF）亦与COPD相关气道重构、纤维化和上皮-间质转化有关。基于此，研究人员整合COPD相关批量与单细胞转录组数据集，采用锰相关基因评分、差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基于机器学习的生物标志物筛选、分子分型和单细胞分析，旨在鉴定锰相关分子特征及与肺血管重构相关的关键调控候选因子，重点关注HBEGF及其与JUN活性和内皮-平滑肌通讯的潜在关系。研究得出，COPD中锰相关转录评分升高，鉴定出43个锰-COPD相关候选基因和14基因核心特征，HBEGF被优先锁定并与静脉内皮细胞状态改变相关，伪时序和转录因子分析提示潜在JUN/HBEGF调控关系，CellChat和NicheNet分析为潜在内皮-平滑肌通讯提供证据，从而将锰相关转录特征与COPD内皮功能障碍和肺血管重构联系起来。其重要意义在于为COPD肺血管病理机制提供可检验的假设，但研究基于回顾性公共数据集，不能推断因果关系，锰相关评分仅为转录组代理指标而非直接锰暴露测量，诊断模型和单细胞发现仍需前瞻性队列及空间和实验方法验证。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员基于公共数据库获取COPD批量转录组数据集，以GSE47460（含GPL6480和GPL14550平台）为训练队列、GSE106986为外部验证队列，单细胞RNA测序数据来自GSE173896（选取5例COPD和3例对照共8个样本）。锰相关基因集来自比较毒理基因组学数据库（CTD）和GeneCards，合并去重后保留5514个独特基因。主要方法包括基于GSVA框架的单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分、limma差异表达分析、WGCNA、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集及STRING蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析、LASSO回归/随机森林/支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）特征筛选、一致性聚类分子分型、多模型机器学习比较与SHAP解释、Seurat单细胞处理与注释、CytoTRACE2发育潜能推断、monocle3伪时序分析、decoupleR/OmniPathR转录因子活性推断、CellChat细胞通讯和NicheNet配体-靶基因分析。
研究结果方面，3.1 锰相关转录特征在COPD样本中增强并鉴定43个锰-COPD相关基因：通过GSVA/ssGSEA评分发现COPD样本锰相关转录评分显著高于对照（P = 1.994 × 10-7，Wilcoxon效应量r = 0.216，95% CI 0.13–0.30）；差异表达分析鉴定752个差异表达基因（258个上调、494个下调）；WGCNA显示MEyellow（r = 0.59，BH-FDR = 9.39 × 10-44）和MElightcyan（r = 0.54，BH-FDR = 1.27 × 10-35）与锰相关评分显著正相关并作为关键模块，模块成员度与基因显著性呈正相关；将COPD差异基因、WGCNA关键模块基因和锰相关基因取交集，鉴定43个锰-COPD相关候选基因。3.2 锰-COPD相关基因功能表征与14基因诊断模型构建：通过STRING构建置信度>0.7的PPI网络，HBEGF、IL6、CXCL3、PTGS2、SERPINE1、SELE、CD69和S100A9位于相对中心位置；KEGG富集显示候选基因主要富集于IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、AGE-RAGE信号通路及脂质与动脉粥样硬化通路，GO富集主要涉及炎症反应调控、趋化、白细胞迁移、细胞因子活性和趋化因子活性；LASSO、随机森林和SVM-RFE三种算法交集得到14个核心诊断候选基因（HBEGF、PER1、CD69、IL13、PTGS2、CXCL3、FGG、LIF、SERPINE1、PTX3、S100A9、FGA、SELE、IL4）；基于14基因的联合诊断模型在训练队列曲线下面积（AUC）为0.883、外部验证队列为0.800，决策曲线分析显示较“全部治疗”或“不治疗”策略具有更高净获益，但外部验证队列校准曲线偏离理想校准。3.3 核心基因将COPD样本分为两个分子亚型：通过基于14个核心基因表达谱的无监督一致性聚类，确定k = 2为最佳聚类数，将COPD样本分为Cluster 1和Cluster 2；Cluster 1锰相关转录评分显著高于Cluster 2（P = 9.576 × 10-19，Cohen's d = 1.317，95% CI 0.99–1.64）；差异GO和KEGG富集显示Cluster 2上调功能主要与错配修复、嘧啶代谢、DNA共价交联修复和N-酰基乙醇胺代谢过程相关，下调功能主要与白细胞介素-1介导信号、白细胞介素-1产生、炎症反应调控、AP-1转录因子复合体和白细胞介素-6受体结合相关；通路分析显示Cluster 2上调通路主要涉及DNA修复过程，下调通路包括NF-κB信号、IL6-JAK-STAT3信号、KSHV vGPCR至PI3K/AKT信号和血管紧张素II刺激的NOX信号；免疫浸润分析显示两亚型间多种免疫细胞群体存在显著差异，提示Cluster 1更接近炎症激活和免疫相关表型而Cluster 2以DNA修复和代谢重塑程序为特征。3.4 多模型机器学习比较鉴定HBEGF为ElasticNet模型中的关键解释特征：通过构建并比较多种监督机器学习模型，内部验证队列ROC曲线显示多数模型具有COPD判别能力，随机森林、逻辑回归、ElasticNet、朴素贝叶斯、线性判别分析和支持向量机表现相对较好；外部验证队列中ElasticNet模型保持相对稳定的分类能力；全局特征重要性分析显示HBEGF为排名第一的基因特征，其后为PER1、CD69、IL13、PTGS2、CXCL3、FGG、LIF和SERPINE1；SHAP汇总分析显示HBEGF、PER1、CD69、IL13和PTGS2对模型预测贡献显著，其中HBEGF总体贡献最突出；代表性样本的局部解释和瀑布图显示HBEGF、PER1、IL13和CD69使模型输出偏向COPD预测，而PTGS2等特征在该样本中贡献相反；据此HBEGF被优先用于后续单细胞定位和机制分析。3.5 单细胞分析将HBEGF表达与COPD静脉内皮细胞状态改变联系起来：通过分析8个肺样本（5例COPD、3例对照）单细胞转录组数据，质控后保留24018个细胞，其中内皮细胞3890个，基于经典标志基因注释出主要肺细胞类型，UMAP显示COPD与对照样本细胞组成存在差异；HBEGF在多种肺细胞群体中表达并在若干细胞类型中显示疾病相关差异，内皮细胞中HBEGF表达疾病相关差异显著，提示内皮细胞可能是COPD肺组织异常HBEGF表达的重要细胞来源；提取内皮细胞进行亚群分析，注释为动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞和淋巴内皮细胞，UMAP显示各亚群分布于相对独立的转录区域且COPD与对照组间内皮亚型比例发生改变；CytoTRACE2分析显示不同内皮亚群发育潜能分布不同，COPD与对照组间内皮亚群CytoTRACE2评分存在显著差异，尤其静脉内皮细胞和毛细血管内皮细胞；HBEGF表达与CytoTRACE2评分在多个内皮亚群中呈正相关，静脉内皮细胞中关联更明显，提示COPD中异常HBEGF表达可能与静脉内皮细胞状态改变密切相关。3.6 伪时序和转录因子分析提示静脉内皮细胞中潜在JUN/HBEGF调控关系：通过monocle3伪时序分析显示内皮亚群沿轨迹连续分布并占据不同轨迹区域，内皮亚型标志基因在不同伪时序阶段呈亚型特异性表达模式；HBEGF沿内皮伪时序轨迹呈亚群特异性动态模式，静脉内皮细胞中COPD组HBEGF表达沿伪时序逐渐升高而对照组趋势较弱，毛细血管内皮细胞中HBEGF表达相对较低且动态变化有限，动脉内皮细胞模式不同于静脉内皮细胞，提示COPD中异常HBEGF表达可能优先发生于静脉内皮细胞状态转换过程；转录因子活性推断显示JUN与HBEGF表达相关性最高（Spearman ρ = 0.28，名义P < 2.2 × 10-16，BH-FDR < 0.001），其后为SP1、EGR1、AR、HIF1A和TP53；静脉内皮细胞中尤其COPD组HBEGF表达和JUN活性沿伪时序均升高，而毛细血管和动脉内皮细胞中该同步模式较弱或不一致；HBEGF启动子区预测到多个JUN结合位点，包括靠近转录起始位点且基序评分较高的位点，综合支持COPD相关静脉内皮细胞中潜在JUN/HBEGF调控关系。3.7 细胞通讯和NicheNet分析提示潜在HBEGF相关内皮-平滑肌通讯：通过CellChat比较对照组和COPD组全局细胞通讯，COPD中推断的相互作用数量减少（对照1992个、COPD 1860个），总体相互作用强度由27.163降至24.181；接收细胞分析显示静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞及多种免疫细胞群体相互作用强度在COPD中发生改变；向静脉内皮细胞的主要信号来源分析显示中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、T细胞、动脉内皮细胞、成纤维细胞、AT2细胞、淋巴内皮细胞和静脉内皮细胞均向静脉内皮细胞贡献信号且强度在两组间存在差异；全局通讯网络显示两组肺组织存在广泛细胞间相互作用，配体-受体气泡图显示COPD条件下多种细胞群体间差异通讯信号，包括静脉内皮细胞与平滑肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞间潜在相互作用；NicheNet分析以静脉内皮细胞为发送细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞为接收细胞，平滑肌细胞为接收细胞时HBEGF在114个候选配体中排名第28位（Pearson配体活性评分0.0139，排名第一的CXCL12评分为0.0884），成纤维细胞为接收细胞时HBEGF在118个候选配体中排名第66位（评分0.0992，排名第一的TGFB1评分为0.1752）；基于HBEGF在批量转录组、机器学习和内皮分析中的优先性，选择平滑肌细胞进行下游靶基因探索，NicheNet靶基因预测显示HBEGF可能调控平滑肌细胞中CSF1R、CDKN1A、MYC、PIM1、IRF1、BCL3、BHLHE40、VEGFA、ICAM1、IER3、SERPINE1和BBC3等下游基因，这些靶基因与炎症反应、细胞增殖、血管生成、细胞黏附和细胞外基质重塑相关，提示静脉内皮细胞来源HBEGF可能通过旁分泌信号影响平滑肌细胞转录状态。
讨论部分总结：研究人员指出COPD中锰相关转录评分升高虽高度显著但效应量中等（r = 0.216），提示其为组水平分子差异而非个体间完全分离，且该评分反映的是精选锰相关转录程序活性而非锰暴露直接测量；两个COPD分子亚型间差异更明显（Cohen's d = 1.317），提示该转录程序可能与COPD分子异质性关系更密切。WGCNA鉴定的MEyellow和MElightcyan关键模块及43个基因富集于IL-17、TNF、NF-κB、NOD样受体、AGE-RAGE和细胞因子-细胞因子受体通路，将特征与炎症激活、免疫募集和血管重构联系起来。14基因核心特征在训练和外部验证队列具有较好分类性能，但模型需在前瞻性队列中进一步评估；一致性聚类划分的两个分子亚型具有不同锰相关评分和功能特征，Cluster 1免疫炎症特征更强而Cluster 2与DNA修复和代谢重塑程序更相关。HBEGF作为连接批量转录改变与细胞类型特异性过程的关键候选，既往研究已将其与COPD严重程度、气道纤维化、上皮-间质转化、炎症放大和气道重构相关联；单细胞分析显示HBEGF在内皮细胞中呈显著疾病相关模式，其表达与CytoTRACE2发育潜能正相关，尤其在静脉内皮细胞中。伪时序和转录因子分析提示JUN活性与HBEGF表达潜在调控关系，JUN在BH校正后与HBEGF相关性最高但其他转录因子关联幅度相似，COPD静脉内皮细胞中HBEGF表达和JUN活性沿伪时序升高且HBEGF启动子区预测到JUN结合位点，支持需实验验证的潜在JUN/HBEGF调控关系。CellChat和NicheNet将发现扩展至细胞间通讯，CXCL12和TGFB1分别对平滑肌细胞和成纤维细胞显示最高预测配体活性，HBEGF亦被鉴定为预测配体之一；CXCL12/CXCR4信号与肺血管重构包括平滑肌细胞增殖和内皮祖细胞反应有关，TGF-β信号通过间充质细胞活性、细胞外基质沉积和内皮表型改变参与血管重构，吸烟者和COPD患者肺动脉中已有TGF-β/SMAD信号改变及内皮-间质转化相关过程报道，为预测的CXCL12、TGFB1和HBEGF信号相互作用提供生物学背景。研究人员提出工作模型：锰相关转录改变通过炎症和内皮重塑程序与COPD血管病理相联系，静脉内皮细胞中JUN相关HBEGF表达可能促进内皮-平滑肌通讯和血管重构相关转录反应，为未来机制研究提供可检验假设。局限性包括：研究主要基于回顾性公共数据集，不能推断锰相关转录特征、HBEGF表达、内皮状态改变与COPD进展间因果关系；锰相关评分是转录组代理而非锰暴露直接测量，需整合锰暴露测量与匹配转录组数据；诊断模型需在更大前瞻性队列和临床可及样本中进一步评估；单细胞发现和提出的JUN/HBEGF相关内皮-平滑肌通讯模型需空间和实验方法进一步验证。研究结论翻译：本研究鉴定出COPD中升高的锰相关转录评分，并将HBEGF优先锁定为与静脉内皮细胞状态改变相关的候选因子。整合单细胞、伪时序、转录因子、CellChat和NicheNet分析提示COPD肺血管重构中存在潜在JUN/HBEGF相关内皮特征并预测内皮-平滑肌通讯。这些发现为进一步实验研究提供假设，但未确立锰暴露的直接效应或JUN-HBEGF调控机制的因果关系。
