基于RAA-CRISPR/Cas12a技术的鸡肉中鲁氏不动杆菌快速检测方法的建立

《Food Research International》：Establishment of a rapid detection method for Acinetobacter lwoffii in chicken based on RAA-CRISPR/Cas12a technology

鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii，A. lwoffii）作为不动杆菌属的重要成员，通常被视为条件致病菌，呈革兰染色阴性，可存在于土壤、水体或食品加工环境中，对免疫力低下的人群或动物构成潜在致病威胁。在食品安全领域，不动杆菌亦是污染来源之一。研究表明，该菌可从鸡肉等动物源性食品中分离检出，亦可见于蔬菜、水果、生鲜乳及水产品中。食用受污染食品后，鲁氏不动杆菌可引起急性胃肠炎、腹泻等消化道症状，严重时可导致败血症、脑膜炎等侵袭性感染。与沙门菌、弯曲杆菌等主要食源性致病菌相比，尽管鲁氏不动杆菌未被列为重点监测对象，但其在鸡肉中的检出率（3.2%–8.7%）已接近甚至超过部分传统致病菌。2023年全球禽肉消费量达1.04亿吨，较2022年增长1.6%，呈持续稳步上升趋势，禽肉占全球肉类总消费量的40%，已成为消费量最大的肉类品类之一。随着冷链物流网络的扩展及禽产品交易半径的持续扩大，鲁氏不动杆菌在加工、贮藏和运输过程中的交叉污染与传播风险相应增加。因此，建立适用于全生产流通链条的快速检测技术具有现实必要性。目前，鲁氏不动杆菌的标准检测方法主要为分离培养法，但该方法耗时较长。基于PCR（聚合酶链式反应）以16S rRNA等引物建立的分子生物学检测已成为鲁氏不动杆菌检测的主要方法，但PCR检测存在操作繁琐、对扩增设备要求高、成本较高等缺点，显著制约了PCR检测的推广应用。因此，有必要建立一种新的快速、准确的检测方法以快速鉴定鲁氏不动杆菌。RAA-CRISPR/Cas12a技术的核心是RAA（重组酶介导等温核酸扩增，Recombinase-Aided Amplification）等温扩增结合CRISPR/Cas12a特异性识别信号放大。首先从鸡组织中提取鲁氏不动杆菌核酸，利用重组酶和DNA聚合酶在37–42 °C恒温条件下短时间内特异性扩增富集目标菌特异基因片段，该过程无需传统PCR所用的变温设备。特异设计的向导RNA（guide RNA，gRNA）引导Cas12a靶向目标DNA，识别特定PAM位点后激活酶活性并触发非特异性反式切割，切割预加入体系中的报告分子，最终通过荧光信号或试纸条观察获得结果。该技术操作简便、灵敏度和特异性高，适于快速现场检测。与PCR等其他技术相比，该技术操作更简单，更适于现场快速诊断，为疾病早期诊断提供了依据。多项研究报道RAA-CRISPR/Cas12a技术已广泛应用于医学和食品检测等领域。鉴于上述背景，本研究以从肉鸡养殖场鸡肉中分离的鲁氏不动杆菌为对象，通过前期16S rRNA测序和耐药基因检测确认该菌株携带种特异性标记基因OXA-134，在此基础上建立了靶向OXA-134基因的RAA-CRISPR/Cas12a快速检测方法。该方法可在37 °C等温条件下约43 min内完成检测（RAA扩增30 min，Cas12a切割13 min），LOD??（95%置信度下的检测限）为1.84 × 10² copies/μL，结果可直接通过试纸条读取，无需复杂仪器，旨在为动物源性食品中鲁氏不动杆菌污染风险的现场筛查提供技术手段，同时为食品中其他耐药致病菌的快速检测提供参考。

鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）为不动杆菌属重要成员，通常被视为条件致病菌，呈革兰染色阴性，存在于土壤、水体或食品加工环境中，对免疫力低下人群或动物构成潜在致病威胁。在食品安全领域，不动杆菌亦为污染来源之一，可从鸡肉等动物源性食品中分离检出，亦见于蔬菜、水果、生鲜乳及水产品中。食用受污染食品后，该菌可引起急性胃肠炎、腹泻等消化道症状，严重时可导致败血症、脑膜炎等侵袭性感染。与沙门菌、弯曲杆菌等主要食源性致病菌相比，尽管鲁氏不动杆菌未被列为重点监测对象，但其在鸡肉中的检出率（3.2%–8.7%）已接近甚至超过部分传统致病菌。2023年全球禽肉消费量达1.04亿吨，较2022年增长1.6%，占全球肉类总消费量的40%，已成为消费量最大的肉类品类之一。随着冷链物流网络扩展及禽产品交易半径扩大，鲁氏不动杆菌在加工、贮藏和运输过程中的交叉污染与传播风险相应增加，因此建立适用于全生产流通链条的快速检测技术具有现实必要性。目前标准检测方法主要为分离培养法，但耗时较长；基于PCR（聚合酶链式反应）以16S rRNA等引物建立的分子生物学检测已成为主要方法，但PCR存在操作繁琐、对扩增设备要求高、成本较高等缺点，显著制约其推广应用。因此有必要建立新的快速准确检测方法。RAA-CRISPR/Cas12a技术核心为RAA（重组酶介导等温核酸扩增，Recombinase-Aided Amplification）等温扩增结合CRISPR/Cas12a特异性识别信号放大：首先提取鸡组织中鲁氏不动杆菌核酸，利用重组酶和DNA聚合酶在37–42 °C恒温条件下短时特异性扩增富集目标菌特异基因片段，无需传统PCR变温设备；特异性设计的向导RNA（guide RNA，gRNA）引导Cas12a靶向目标DNA，识别特定PAM位点后激活酶活性并触发非特异性反式切割，切割预加入体系的报告分子，最终通过荧光信号或试纸条观察结果。该技术操作简便、灵敏度和特异性高，适于现场快速检测。鉴于上述背景，本研究以从肉鸡养殖场鸡肉中分离的鲁氏不动杆菌为对象，经前期16S rRNA测序和耐药基因检测确认该菌株携带种特异性标记基因OXA-134，据此建立靶向OXA-134基因的RAA-CRISPR/Cas12a快速检测方法。该方法可在37 °C等温条件下约43 min内完成检测（RAA扩增30 min，Cas12a切割13 min），LOD??为1.84 × 10² copies/μL，结果可直接经试纸条读取，无需复杂仪器，旨在为动物源性食品中鲁氏不动杆菌污染风险的现场筛查提供技术手段，并为食品中其他耐药致病菌的快速检测提供参考。研究人员开展了RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立与系统优化，涵盖阳性标准质粒构建与验证、RAA引物筛选、RAA扩增条件（温度、时间、引物浓度）优化、gRNA设计、Cas12a切割活性验证与脱靶对照、Cas12a检测模块（Cas12a浓度、Cas12a与gRNA比例、ssDNA报告分子用量、反应时间）优化，以及特异性、灵敏度、重复性和临床样本验证。结果表明，最优RAA条件为37 °C、30 min、引物终浓度600 nM；最优Cas12a检测条件为Cas12a 200 nM、Cas12a与gRNA摩尔比2:1、ssDNA 1.0 μL、37 °C反应13 min；该方法与8种常见食源性细菌无交叉反应，LOD??为1.84 × 10² copies/μL，104份临床鸡组织样本检测结果与传统金标准（分离培养结合16S rRNA测序）完全一致（敏感性100%、特异性100%、总符合率100%）。该方法设备要求低、操作简便、结果可肉眼判读，适于养殖场、屠宰场和市场监督等现场快速筛查，为动物源性食品中鲁氏不动杆菌污染风险的现场监测提供了可行技术手段，并为其他耐药致病菌快速检测提供参考。关键技术方法：以鸡肉源鲁氏不动杆菌（GenBank登录号PP389585）基因组DNA为模板，PCR扩增OXA-134靶片段并构建pMD-18 T-OXA-134阳性标准质粒，经Hind III和Kpn I双酶切验证并计算质粒拷贝数浓度；设计3对RAA引物及3条gRNA，以LbCas12a为核心建立RAA-CRISPR/Cas12a两步检测体系，采用侧向流试纸条读取结果并以ImageJ 1.53c软件扫描T/C线灰度值计算T/C比值进行定量判定；系统优化RAA温度、时间、引物浓度及Cas12a浓度、Cas12a与gRNA比例、ssDNA用量和反应时间；以8种对照菌验证特异性，以10倍梯度稀释标准质粒（10次技术重复）确定LOD??，并进行组内和组间重复性评估；临床样本来自2025年3–5月通辽市某肉禽加工有限公司屠宰线采集的104份鸡胸组织样本，以传统分离培养结合16S rRNA测序为金标准进行一致性分析。研究结果：（1）标准质粒构建与验证结果：重组质粒经Hind III和Kpn I双酶切后电泳出现两条清晰条带，大小与pMD-18 T载体（2692 bp）和OXA-134靶基因（280 bp）预期一致，未酶切重组质粒及空载体对照各呈单一条带，表明OXA-134基因片段已成功连接入pMD-18 T载体；质粒母液浓度为598.6 ng/μL，拷贝数为1.84 × 10¹¹ copies/μL。（2）RAA引物筛选结果：常规PCR中3对引物均可扩增出280 bp预期条带，RAA-1扩增条带最亮（校正灰度值253.4），RAA-3次之（209.4），RAA-2最弱（128.9）；基础RAA等温扩增体系中RAA-1条带最亮（214.8）且无非特异性扩增，RAA-3虽可扩增（118.7）但拖尾明显、特异性差，RAA-2扩增效率最低（86.1），故选择RAA-1引物用于后续体系构建。（3）RAA扩增条件优化结果：37 °C条带最亮（灰度值246.1）、清晰集中且无非特异性扩增，确定为最佳温度；30 min条带最亮（227.8）、清晰，确定最佳时间；引物终浓度600 nM条带最亮（233.1）且清晰明亮，确定最佳工作浓度。（4）Cas12a蛋白活性验证结果：gRNA2搭配PCR产物信号最强（1.171），gRNA1搭配RAA产物（1.111）和gRNA2搭配RAA产物（1.109）次之，gRNA3搭配RAA产物较弱（1.052）但仍显著高于阈值（P < 0.001）；缺失Cas12a、ssDNA、gRNA1、gRNA2或gRNA3时T/C值分别为0.798、0.858、0.786、0.832、0.749，T线均无色、低于阈值，表明各组分缺一不可；以鲍曼不动杆菌RAA产物为非靶核酸对照，T/C值为0.794，与空白对照（0.772）接近（P > 0.05），排除Cas12a非靶切割可能；各组3次重复CV均小于4.0%，重复性良好。（5）RAA-CRISPR联合反应体系优化结果：Cas12a浓度25–250 nM梯度中200 nM时T/C值最高（1.286，P < 0.0001），增至250 nM无显著提升，故选200 nM；Cas12a与gRNA比例2:1时T/C值最高（1.225），与1:1组（1.219）无显著差异（P > 0.05），但显著高于1:2（1.183）、1:3（1.182）、1:4（1.189）组（P < 0.01），且2:1组T线显色最快，故选2:1；ssDNA用量1.0 μL（终浓度0.5 μM）时T/C值最高（1.365，P < 0.0001），1.2 μL时降至1.289且CV较大（5.66%），故确定1.0 μL；反应时间13 min时T/C值最高（1.315），显著高于5、8、10 min组（P < 0.01），与18 min（1.310）、20 min（1.313）组无显著差异（P > 0.05），故设定13 min。（6）RAA-CRISPR/Cas12a特异性检测结果：优化RAA条件下仅鲁氏不动杆菌模板孔出现单一明亮预期条带，8种对照菌基因组DNA经RAA扩增均无扩增条带；优化检测体系下仅鲁氏不动杆菌为阳性（T/C比值1.252，显著高于阈值0.785，P < 0.0001），8种对照菌T/C比值为0.627–0.757，均低于阈值判为阴性，各组CV均小于5.1%，表明该方法对鲁氏不动杆菌特异性良好，与相关菌及常见菌无交叉反应。（7）RAA-CRISPR/Cas12a灵敏度检测结果：试纸条T线信号强度与初始模板浓度正相关，模板浓度1.84 × 10² copies/μL时10次重复仍可检出阳性但T线颜色明显减弱，降至1.84 × 10¹ copies/μL及以下时T线完全消失仅保留C线；以阴性对照T/C比值Mean + 3SD（0.702）为阳性判定阈值，1.84 × 10²–1.84 × 10⁷ copies/μL各组T/C比值均高于阈值、10次重复全部阳性，1.84 × 10¹和1.84 × 10⁰ copies/μL组均低于阈值、10次重复全部阴性，据此确定LOD??为1.84 × 10² copies/μL（即50 μL RAA反应体系加1 μL模板时的最低可检浓度）。（8）RAA-CRISPR/Cas12a重复性试验结果：组内重复3个浓度T/C比值分别为6.25、3.95、1.95（n = 3），CV分别为29.2%、5.8%、9.2%；组间重复T/C比值分别为5.65、3.85、1.88（n = 3），CV分别为19.4%、8.3%、10.6%；1.84 × 10⁶和1.84 × 10⁵浓度组组内和组间CV均小于11%，重复性良好；1.84 × 10⁷浓度组CV较高，可能因高浓度模板对RAA扩增的轻微抑制作用导致批间差异增大，但该浓度远高于实际检测需求，不影响方法实用性。（9）临床样本检测结果：共检测104份临床鸡组织样本，按金标准确认阳性23份、阴性81份；RAA-CRISPR/Cas12a试纸条法敏感性100%（23/23）、特异性100%（81/81）、总符合率100%（104/104），与金标准完全一致，达到与常规PCR法相同的准确性。讨论部分总结：研究指出，准确鉴定菌株是保障食品安全的前提，OXA-134基因是鲁氏不动杆菌染色体上固有的碳青霉烯酶D类β-内酰胺酶编码基因，不存在于鲍曼不动杆菌等近缘菌及常见食源性细菌中，具有高度种特异性，以其为靶标不仅可实现菌种鉴定，还可同时识别碳青霉烯耐药风险，对食品中耐药菌监测具有双重价值。本研究将RAA等温扩增与CRISPR/Cas12a切割整合为两步检测体系，前者解决等温扩增灵敏度问题，后者通过序列特异性识别抑制非特异性扩增导致的假阳性，二者互补使全程在灵敏度与特异性之间取得平衡。与已报道的RPA-CRISPR/Cas12a、多RPA-Cas12a等方法相比，本方法LOD??为1.84 × 10² copies/μL，与上述平台处于同一数量级，灵敏度与常规PCR相当；检测速度约43 min（RAA 30 min + Cas12a 13 min），与同类RPA-CRISPR/Cas12a技术（30–60 min）基本一致，但快于SHERLOCK等早期CRISPR系统；与一步法LAMP-CRISPR/Cas12b相比，两步法操作步骤略多，但避免了扩增与切割在同一体系中的相互干扰，各模块反应条件可独立优化。现场适用性是该方法的突出特点，全程仅需水浴锅等简单恒温设备，结果经CRISPR试纸条肉眼判读，无需荧光定量PCR仪或凝胶成像系统；传统PCR需3–4 h且依赖PCR仪和电泳设备，16S rRNA测序虽为金标准但需2–3天且成本高，均难以满足现场快速筛查需求。该方法操作门槛较低，经简单培训人员即可完成检测，符合现场快速筛查实际需要。鲁氏不动杆菌可在食品加工设备表面形成生物膜，常规清洗消毒难以完全清除，成为肉制品交叉污染的持续来源，本方法约43 min的检测周期可为食品加工卫生监测提供实时数据支持，有助于在交叉污染扩散前实施控制措施；随着该菌耐药性增强，食源性感染治疗难度上升，靶向耐药基因可在检测过程中同时获得菌株鉴定和耐药预警。动物源性食品样本常含血红蛋白、脂肪、多酚等PCR抑制剂，传统PCR易出现扩增失败或效率降低，而RAA的重组酶介导链置换机制更耐抑制剂，反应体系中多种辅助蛋白（如单链结合蛋白、DNA聚合酶等）的协同作用亦增强其在复杂基质中的稳定性；本研究104份临床鸡组织验证结果与金标准100%一致，进一步证实该方法对禽肉基质的适应性，但对高度腐败或经强防腐剂处理的样本，仍需在DNA提取阶段增加纯化步骤，后续可考虑将磁珠富集、膜浓缩等前处理技术与本方法结合以提高低载菌样本检出率。该方法目前仍存在一定局限性：其一，阳性标准质粒来自单一鲁氏不动杆菌菌株，OXA-134基因在不同地理来源和不同宿主分离株中的稳定性尚需验证，未来需更多多菌株检测数据证实方法普适性；其二，两步操作增加步骤数和污染风险，新近出现的光引发一步法RPA-CRISPR/Cas12a技术通过crRNA光解修饰实现扩增与切割的时间分离，在保持高灵敏度的同时简化操作，可作为升级参考；其三，试纸条判读目前依赖T/C比值定性分析，尚未建立定量标准曲线，未来可尝试引入AI图像识别，利用深度学习对显色强度进行量化以实现半定量检测；近期开发的涡旋驱动液滴数字CRISPR（VTD-CRISPR）平台通过快速涡旋在数秒内生成数万个均匀皮升级液滴，无需微流控芯片或专用设备，可实现转基因产品绝对定量检测，其结果与数字PCR高度一致，该策略为CRISPR检测从定性向定量升级提供了新思路，未来可利用其液滴分割理念结合智能手机图像分析，建立鲁氏不动杆菌或其他食源性致病菌的半定量或绝对定量检测方法。该方法以耐药基因为靶标的设计思路具有良好普适性，检测体系策略可扩展至携带特征性耐药基因的其他食源性致病菌，如携带mecA的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、携带NDM的肠杆菌科细菌，为构建多靶标食品安全现场监测网络提供技术参考；在即时防控层面，定期采用本方法监测食品加工环境中鲁氏不动杆菌污染，并依据监测数据调整清洗消毒方案，有助于从源头降低交叉污染风险。研究结论部分翻译：本研究建立的RAA-CRISPR/Cas12a联合检测方法以种特异性基因OXA-134为靶标，可在37 °C等温条件下约43 min内完成检测，LOD??为1.84 × 10² copies/μL，与8种常见食源性细菌无交叉反应，104份临床鸡组织验证与金标准符合率为100%。该方法设备要求低、操作简便、结果可肉眼判读，适于养殖场、屠宰场和市场监督等现场快速筛查，为动物源性食品中鲁氏不动杆菌污染风险的现场监测提供了可行技术手段。