分馏方法对蛋白质体外消化率可靠定量的比较研究：基于15N标记酪蛋白与蚕豆的切向过滤与化学沉淀法评估

《Food Research International》：A comparison of fractionation methods for the reliable in vitro quantification of protein digestibility

鉴于人口增长以及膳食对健康和环境的影响，当前共识是推广植物基蛋白以实现更健康、更可持续的膳食（Willett et al., 2019）。这要求能够评估其营养质量。目前推荐的蛋白质质量评价标准为可消化必需氨基酸评分（DIAAS），其计算一方面基于化学评分，即将膳食蛋白的氨基酸（AA）模式与所谓参考蛋白相比较（FAO, 2013; Tessier et al., 2021），另一方面基于每种氨基酸的真实或实际回肠消化率。后者需要体内测定，而鉴于法规要求和社会接受度呼吁减少、替代和优化（即3Rs原则）动物实验（DIRECTIVE, 2010/63/UE, 2010），这正变得困难。因此需要可靠的体外方法来研究蛋白质消化率并确定蛋白质质量。自2014年以来，INFOGEST联盟已开发出用于模拟成人消化条件的静态体外消化共识方案（Brodkorb et al., 2019; Minekus et al., 2014）。近期，多位作者证明，该静态方案结合甲醇消化物分馏，可基于消化释放且可能被吸收（即生物可及）的氮（N）或AA比例来估算体外蛋白质消化率（IVPD）（Egger et al., 2026; Gómez-Marín et al., 2026; Martineau-C?té et al., 2024; Oh et al., 2025; Sousa et al., 2023）。 体外消化后，需要分馏步骤将生物可及（即可消化）物质与非生物可及物质分离。一个关注点在于缺乏刷状缘肽酶，这导致消化结束时肽的分子量（Mw）高于体内回肠释放肽的分子量（Brodkorb et al., 2019; Martineau-C?té et al., 2024; Picariello et al., 2015）。分馏方法的选择很重要，因为被视为生物可及的肽的最大尺寸取决于截留分子量（MWCO）。虽然该截留阈值必须高于肠道吸收的生理阈值（1–0.5 kDa）以补偿刷状缘酶的缺乏，但其确切值仍有争议，不同研究报道为1至10 kDa（Ari?ns et al., 2021; Duijsens et al., 2023; Le Roux et al., 2020; Lee et al., 2024; Sousa et al., 2023）。研究人员近期一项比较最常见分馏方法对生物可及部分肽谱影响的研究，使研究人员选择了两种效能相似的化学沉淀方法，即用4.5%磺基水杨酸（SSA）或80%甲醇沉淀（Pogu et al., 2026）。用甲醇对体外消化物进行分馏以定量IVPD正处于标准化过程中（Egger et al., 2026）。对科学文献的分析表明，在过去十年（2014–2024年）中，仅离心或先经化学分馏再离心是估算IVPD最常用的两种方法（各约占研究的45%）。此前已表明，未分馏消化物与仅离心消化物之间的生物可及肽谱相似，未去除主要来自胰酶的>10 kDa肽。该类肽仅通过化学分馏被去除，因此与仅离心相比效率更高（Pogu et al., 2026）。相反，过滤方法很少使用（<5%的研究），可能因为其更昂贵且更耗时，但它可能更具生理相关性，因为它允许模拟吸收步骤。因此在本研究中，研究人员研究了另一种较少使用的分馏方法，即切向过滤，如先前在静态消化中所使用（Ari?ns et al., 2021）。该研究显示超滤（MWCO为5 kDa）后获得的AA消化率具有良好的重现性，但这可能需要进一步探索。 进行体外消化时的另一个关注点是内源性N/AA的存在，这会偏倚IVPD。这种内源性物质主要来源于加入反应介质的胰酶，其本身是生物可及AA和肽的重要来源，尤其是以胰酶这类非纯化形式加入时。胆盐和胃蛋白酶也对内源性N物质有贡献，但与胰酶相比程度低得多（分别为13%和2%）（Ménard et al., 2023）。此外，正如它们水解消化中的膳食蛋白底物一样，胰腺蛋白酶也可以消化脂肪酶或淀粉酶，甚至发生自溶，从而释放出在分馏过程中无法与底物来源肽相区分的肽。消化过程中，由胰腺蛋白酶自溶及其作用于其他酶产生的生物可及AA/N比例，随加入的胰酶量、膳食底物的存在与否、膳食蛋白来源及其蛋白质含量而变化（Ménard et al., 2023; Qiao et al., 2005）。 在体内条件下，根据如何计入内源性来源的N和AA消化损失，可使用不同术语来限定蛋白质的消化率。如果在测量N消化损失时未对内源性损失进行校正，则使用表观消化率这一术语。基础内源性蛋白质损失可通过无蛋白半纯化日粮测定。当使用此类校正时，所得值在动物营养领域称为标准化消化率，在人类营养领域称为真消化率（FAO, 2014）。在体内条件下，借助本研究使用的稳定氮同位素标记蛋白质，可以估算特定内源性损失。当使用此类校正时，因此最常使用真实消化率这一术语。 为评估真实体外蛋白质消化率（RIVPD），研究人员在成人静态体外消化（Brodkorb et al., 2019）后测试了上述两种预选化学方法，所用两种15N标记蛋白质（酪蛋白和蚕豆）的真实回肠蛋白质消化率（RIPD）值此前已在本实验室人体中测定（Deglaire et al., 2009; Guillin et al., 2022; Itkonen et al., 2024）。研究人员还对相同蛋白质来源进行了切向过滤（标称MWCO为10 kDa），以比较生物可及肽谱是否与化学沉淀所得相似。使用15N标记膳食蛋白使得能够通过特异性追踪膳食N来克服内源性N/AA的问题。因此，本研究的第一目标是评估是否可能使用INFOGEST消化方案，随后用4.5%（w/v）SSA或80%（v/v）甲醇沉淀，可靠地估算两种在不同蛋白质含量下消化的蛋白质的RIVPD。第二目标是比较通过化学沉淀或切向过滤分离的生物可及肽谱。最后，第三目标是评估非生物可及或生物可及部分中内源性N比例随蛋白质来源和蛋白质含量的变化。

研究背景与问题

当前共识倡导推广植物基蛋白以实现更健康、更可持续的膳食，这要求可靠评估其营养质量。现行推荐的蛋白质质量评价标准为可消化必需氨基酸评分（DIAAS），其计算依赖化学评分与每种氨基酸的真实或实际回肠消化率。后者需体内测定，但受法规要求与社会接受度推动的3Rs原则（减少、替代、优化动物实验）制约，动物实验日益受限。因此亟需可靠的体外方法研究蛋白质消化率并确定蛋白质质量。自2014年起，INFOGEST联盟建立了模拟成人消化条件的静态体外消化共识方案，近期研究证明该方案结合甲醇消化物分馏可估算体外蛋白质消化率（IVPD）。然而，体外消化后需分馏步骤分离生物可及与非生物可及物质，关键问题在于缺乏刷状缘肽酶导致消化终产物肽的分子量（M_w）高于体内回肠释放肽，而截留分子量（MWCO）的确切取值在1至10 kDa间存在争议。文献分析显示，2014–2024年间仅离心或化学分馏后离心是估算IVPD最常用的两种方式（各约占45%），过滤方法使用不足5%，可能因其成本更高、更耗时，但更具生理相关性，可模拟吸收步骤。此外，体外消化中内源性N/AA的存在会偏倚IVPD，其主要来源于加入的胰酶（胆盐和胃蛋白酶贡献分别为13%和2%），胰腺蛋白酶的自溶及对其他酶的作用会释放难以与底物来源肽区分的肽。因此本研究旨在评估化学沉淀法能否可靠估算真实体外蛋白质消化率（RIVPD），比较化学沉淀与切向过滤所得生物可及肽谱，并考察内源性N在不同部分中的分布。

研究开展与结论

研究人员采用两种¹⁵N标记膳食蛋白（酪蛋白和蚕豆，其真实回肠蛋白质消化率RIPD已在人体中测定），按INFOGEST成人静态体外消化方案在两种蛋白质含量（5.2%和8.5%）下消化，随后以4.5%（w/v）磺基水杨酸（SSA）或80%（v/v）甲醇进行化学沉淀分馏，并对部分样品行切向过滤（标称MWCO 10 kDa）。借助¹⁵N标记特异性追踪膳食N，克服内源性N干扰。研究结论为：切向过滤与化学试剂可实现相似的N分馏效果；SSA与甲醇沉淀能准确估算真实蛋白质消化率；非生物可及N主要来源于内源性；大部分内源性N在消化后处于生物可及形式。该研究为体外可靠评价蛋白质质量、减少动物实验提供了方法学依据。

关键技术方法

研究以¹⁵N标记的酪蛋白（同位素富集1.80原子百分比AP，来自¹⁵N标记脱脂巴氏杀菌乳的超滤与微滤）和¹⁵N标记蚕豆（田间施肥内在标记，富集1.23 AP，来源为既往人体试验所用样品）为对象，配制成与相应人体试验一致的膳食（半合成酪蛋白餐及煮熟捣碎的脱壳蚕豆餐），设5.2%与8.5%两个蛋白质含量。采用INFOGEST成人静态体外消化方案（口腔、胃、肠三相）消化，每餐三重复。分馏采用4.5%（w/v）SSA沉淀、80%（v/v）甲醇沉淀及切向过滤（10 kDa MWCO透析膜）三种方式。分析手段包括尺寸排阻色谱（SEC）表征肽谱、元素分析仪（EA）耦合同位素比值质谱（IRMS）测定N含量与¹⁵N富集，并据同位素稀释原理计算膳食N与内源性N。

研究结果

2.1 测试蛋白与餐食制备：两种¹⁵N标记蛋白按人体试验餐食形式配制，蛋白质含量经EA测定总N后以特定换算系数（酪蛋白6.38、蚕豆5.4）换算，设5.2%与8.5%两个水平。

2.2 成人阶段体外静态消化：按INFOGEST方案对四种餐食各5 g进行消化，胃蛋白酶2000 U/mL胃内容物，胰酶胰蛋白酶活性达100 U/mL总消化物，每餐三重复。

2.3 消化物分馏：化学沉淀分别采用4.5% SSA与80%甲醇，上清液为生物可及部分、沉淀为非生物可及部分；切向过滤仅对与人体试验蛋白质含量对应的两种餐食进行，以10 kDa MWCO膜过滤90 min，累积滤液（F90）视为生物可及部分。

2.4 消化物分析：以SEC测定生物可及部分肽谱并建立洗脱体积与M_w对数的校准曲线；以EA-IRMS测定沉淀中N含量与¹⁵N富集。

2.5 数据分析：将色谱图按M_w分为>10、[10–5[、[5–2[、[2–1[、[1–0.1[ kDa五类，以曲线下面积（AUC）计算肽分布与N得率；MWCO定义为回收95%肽物质的M_w；依据同位素稀释公式计算膳食N与内源性N。

讨论与结论总结

研究围绕三个目标展开：其一，验证SSA与甲醇沉淀结合INFOGEST方案能否可靠估算两种蛋白质在两种蛋白质含量下的RIVPD；其二，比较化学沉淀与切向过滤分离的生物可及肽谱；其三，评估内源性N在非生物可及与生物可及部分中的比例随蛋白质来源与含量的变化。研究证实切向过滤与化学试剂可实现相似的N分馏，SSA与甲醇沉淀可准确估算真实蛋白质消化率，非生物可及N主要为内源性来源，且大部分内源性N在消化后呈生物可及形式。研究结论为：在¹⁵N标记膳食蛋白辅助下，化学沉淀分馏结合INFOGEST静态体外消化可可靠估算RIVPD，为替代动物实验、标准化IVPD测定提供了方法学支撑。