华凤丹对慢性脑缺血保护作用涉及海马转录组调控与肠道菌群失调调节的研究

《Metabolic Brain Disease》：The protection of chronic cerebral ischemia by Hua-Feng-Dan involves the modulation of hippocampal transcriptome and gut dysbiosis

本研究探讨了华凤丹配方对慢性脑低灌注诱导缺血的保护作用，并通过RNA-seq和16S rRNA-seq探究其分子机制。研究人员采用雄性Sprague-Dawley大鼠进行单侧颈总动脉结扎手术建立慢性脑低灌注（CCH）模型，随后给CCH大鼠饲喂不同华凤丹配方的饲料持续20天。最后进行行为学测试和组织病理学检查。分离海马RNA进行RNA-seq和RT-qPCR分析；提取结肠细菌DNA进行16S rRNA-seq和生物信息学分析。CCH大鼠的行为学测试表现出认知缺陷，海马CA1区神经元受损。Reduced_H（0.5 g/kg）、Original和Nonferment三种华凤丹配方改善了行为缺陷和形态学变化，而Reduced_L（0.25 g/kg）无效。RNA-seq揭示了各组间不同的基因表达模式。差异表达基因的通路分析显示，华凤丹配方改善了涉及胞质Ca2+超载、IGF稳态失衡和中性粒细胞脱颗粒的经典通路；减弱了CCH激活的上游调控因子如IL1B、IL6、TNF、IGF1和葡萄糖代谢。CCH降低的厚壁菌门/拟杆菌门比值被华凤丹配方恢复。CCH增加的普雷沃氏菌科和减少的毛螺菌科得到缓解；CCH增加的ASV1和减少的ASV39在华凤丹治疗后恢复正常。与抗CCH疗效一致，Reduced_L在转录组和肠道菌群分析中均无效。华凤丹配方（Reduced_H、Original和Nonferment）可有效对抗CCH诱导的慢性脑缺血，而Reduced_L无效。其保护机制与海马转录组调控以及调节CCH破坏的肠道菌群失调有关。

研究背景与目的

慢性脑低灌注（Chronic Cerebral Hypoperfusion, CCH）是一种进行性脑血管疾病，主要由脑动脉硬化及其他血管危险因素引起，导致持续性慢性脑缺血。临床上表现为渐进性认知功能下降，与血管性痴呆和阿尔茨海默病密切相关。华凤丹（Hua-Feng-Dan）具有300年治疗脑部疾病的历史，由药母、草药、矿物等成分组成，于2004年获专利认证为脑部药物，2008年被列入国家级非物质文化遗产名录。已有药理学研究表明华凤丹对急性脑缺血性中风、脂多糖联合鱼藤酮或MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤以及PTZ诱导的癫痫发作具有保护作用。然而，华凤丹对慢性脑缺血的作用尚未明确。因此，研究人员开展此项研究，旨在探究华凤丹配方对CCH诱导的慢性脑缺血的保护效果及其分子机制。

研究方法概述

研究人员采用单侧颈总动脉结扎术（Unilateral Common Carotid Artery Ligation）建立雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠CCH模型。实验分为对照组（Cont）、模型组（CCH）、CCH+Reduced_L组（含3%朱砂和3%雄黄，0.25 g/kg）、CCH+Reduced_H组（含3%朱砂和3%雄黄，0.5 g/kg）、CCH+Original组（含10%朱砂和10%雄黄，0.5 g/kg）和CCH+Nonferment组（药母未经3个月发酵，0.5 g/kg），每组10只大鼠。术后次日开始通过饲料给药，持续20天。主要技术方法包括：Morris水迷宫（Morris Water Maze, MWM）和新物体识别测试（Novel Object Recognition Test, NOR）评估认知功能；苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin, HE staining）观察海马CA1区神经元形态；海马RNA提取后进行RNA测序（RNA-seq）并使用DESeq2分析差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）；通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析经典通路和上游调控因子；RT-qPCR验证炎症相关基因和选定DEGs的表达；提取结肠内容物细菌DNA进行16S rRNA测序（16S rRNA-seq）分析肠道微生物组成和多样性。

研究结果

华凤丹对CCH大鼠认知障碍的影响

在MWM测试中，从第三天起CCH大鼠逃逸潜伏期显著长于对照组，而Reduced_H、Original和Nonferment处理组大鼠的逃逸潜伏期随训练次数增加明显缩短，表明这些配方促进了CCH大鼠的空间学习和记忆能力。在NOR实验中，CCH组新物体探索次数显著低于对照组，而Original和Nonferment组探索次数显著高于CCH组，表明华凤丹配方改善了学习记忆能力。Reduced_L处理在所有行为学测试中均未见明显改善效果。

华凤丹对大鼠海马组织HE染色的影响

HE染色结果显示，对照组海马CA1区神经元排列整齐、边缘清晰、形态规则、细胞核清晰。CCH组神经元胞质染色不均、细胞核皱缩深染、排列严重紊乱稀疏。各华凤丹给药组海马神经元排列较整齐、神经元损伤程度减轻、细胞核更清晰，其中Original和Nonferment组神经元数量增加最为显著。

基因表达模式分析和差异表达基因分析

PCA主成分分析显示各组间基因表达模式明显分离，特别是Reduced_H、Original和Nonferment组与CCH组分离明显。与对照组相比，CCH组有45个DEGs（37个上调，8个下调）；Reduced_L组有73个DEGs（54个上调，19个下调）；Reduced_H组有301个DEGs（199个上调，102个下调）；Original组有221个DEGs（26个上调，195个下调）；Nonferment组有521个DEGs（73个上调，449个下调）。

IPA经典通路和上游调控因子分析

IPA分析显示CCH组中“对升高的血小板胞质Ca²⁺的反应”、“IGF转运和摄取调节”和“中性粒细胞脱颗粒”通路被上调，而Reduced_H、Original和Nonferment处理逆转了这些通路的激活。“突触发生信号通路”、“Netrin信号通路”和“CREB神经元信号通路”在CCH组中下降，经华凤丹处理后进一步降低。在上游调控因子方面，CCH组中与炎症（如脂多糖、IL1B、IKBKB、IL6、TNF）和代谢（如β-雌二醇、IGF1、D-葡萄糖、PI3K、APP）相关的13个调控因子被上调，Reduced_H、Original和Nonferment处理减弱了这些上调或将其转向相反方向，而Reduced_L处理与CCH组差异不大。

RT-qPCR分析炎症相关基因

RT-qPCR验证结果显示，与对照组相比，CCH大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-1R、IL-6、iNOS和Hmox1的表达升高，大多数华凤丹配方处理（尤其是Reduced_H、Original和Nonferment）阻止了这些升高，而Reduced_L效果较差。

差异表达基因热图及RT-qPCR验证

热图显示华凤丹处理减弱了CCH大鼠中异常表达的基因，包括Aqp1、Cldn2、Kcnj13、KI、Mfrp和Pnisr的上调。RT-qPCR验证了这6个DEGs的表达趋势与RNA-seq结果一致。

华凤丹对CCH大鼠肠道微生物α多样性的影响

α多样性分析显示，Ace、Chao1和物种丰富度指数在各组间无显著差异。CCH组的Pielou均匀度指数降低，Original和Nonferment处理逆转了这一趋势。Shannon和Simpson指数在CCH组呈下降趋势，Reduced_H、Original和Nonferment处理阻止了这种下降，表明这些配方影响了肠道微生物的均匀度和综合多样性。

华凤丹对CCH大鼠肠道微生物门、科水平和ASV丰度的影响

在门水平上，CCH组拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度从对照组的46.7%增加到59%，而Reduced_H、Original和Nonferment组分别降至39.01%、49.18%和36.94%。CCH组脱硫杆菌门（Desulfobacterota）丰度从1.41%降至0.55%，而Reduced_H、Original和Nonferment组分别升至1.46%、0.62%和1.44%。厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值在对照组为0.85，CCH组降至0.52，Reduced_H、Original和Nonferment组分别升至1.27、0.84和1.39。在科水平上，CCH组酸氨基球菌科（Acidaminococcaceae）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相对丰度显著增加，脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）显著降低，Reduced_H、Original和Nonferment处理有效逆转了这些失调变化，而Reduced_L干预未能恢复。在ASV水平上，CCH组和Reduced_L组ASV1丰度显著增加，而Reduced_H、Original和Nonferment处理使其恢复正常。CCH组ASV39丰度降低，Original和Nonferment组未检测到降低。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，CCH大鼠表现出认知缺陷和神经元损伤，华凤丹配方（Reduced_H、Original和Nonferment）缓解了CCH诱导的行为缺陷并防止了海马CA1区神经元损伤，而Reduced_L无效。海马RNA-seq揭示了各组间的差异基因表达，IPA分析发现与炎症、IGF和葡萄糖代谢以及离子转运相关的经典通路和上游调控因子在CCH大鼠中被上调，而华凤丹配方减弱了这些变化。RT-qPCR验证了RNA-seq的结果。CCH降低的F/B比值被华凤丹配方恢复，CCH增加的肠道菌群失调也被华凤丹配方恢复正常，但Reduced_L在这些组学分析中均无效。

研究结论为：华凤丹配方（Reduced_H、Original和Nonferment）可有效对抗CCH诱导的慢性脑缺血，而Reduced_L无效。其保护机制与海马转录组调控以及调节CCH破坏的肠道菌群失调有关。